陈敏儿，黄启红，熊 娟，伍玲燕，黄璇莹，张云龙，周小游

(广东省测试分析研究所，广东 广州 510000)

1 原理

叶酸 (Folic Acid)是人体必需的维生素之一，可以促进骨髓中幼细胞成熟,人体若缺乏叶酸可引起贫血、肠胃功能紊乱、智力下降等问题，补充过量又会干扰人体锌代谢，增加下一代患自闭症的风险等情况出现。因而对于维生素补充剂的叶酸含量的检测监测十分重要。国标法(GB 5009.211-2014)原理是利用鼠李糖乳杆菌Lactobacillusrhamnosus对叶酸的特异性,在一定控制条件下将菌液接种至含有试样液的培养液中，培养一段时间后测定吸光度根据叶酸含量与吸光度的标准曲线计算出样品中叶酸的含量。试剂盒法是将试样液和叶酸检测培养基加入预包被有Lactobacillusrhamnosus的微孔中，Lactobacillusrhamnosus的生长状况取决于叶酸的含量。添加叶酸作为标准或者作为样品混合物，细菌会一直生长直至叶酸被消耗殆尽。

本文采用两种方法对3种维生素胶囊中叶酸含量检测,对比两种方法的差异性。试验方案及结果如下。

2 试剂、设备与方法

2.1 试剂

乙醇(广州化学试剂厂)；氢氧化钠(广州化学试剂厂)；叶酸测定培养基(北京陆桥)；微生物法定量检测叶酸试剂盒(VitaFast)；磷酸二氢钠(广州化学试剂厂)；抗坏血酸(广州化学试剂厂)；叶酸标准品(中国食品药品检定研究院)；0.22 μm无菌过滤器(Sartorius Stedim)。

2.2 仪器和设备

KQ-800型超声波清洗器(昆山超声仪器)；1900培养箱(BioCELL)；WTS-2000紫外分光光度计(上海慧多)；HWS26型电热恒温水浴锅(上海一恒)；BSC-1000ⅡA2生物安全柜(苏净安泰)； 800TS酶标检测仪(Biotek)；JJ200B电子天平(G&G)。

2.3 方法

2.3.1 国标法(GB 5009.211-2014)

2.3.1.1 样品制备

准确称取0.5 g维生素胶囊内容物到100 mL锥形瓶中，加入80 mL氢氧化钠乙醇溶液，具塞，超声2～4 h至样品完全溶解或分散，用水定容至刻度。根据样品中叶酸含量对提取液进行适当稀释。

2.3.1.2 标准品溶液制备

取试管依表1分别加入叶酸标准工作溶液(0.2 ng/mL)和无菌水，再加入5.0 mL叶酸测定用培养液，混匀。

表1 标准曲线溶液制备(国标法)

2.3.1.3 培养基制备

依照标准将叶酸测定培养基与叶酸标准工作液或样品稀释液混匀，加塞，高压灭菌。

2.3.1.4 培养

待测定系列管冷却至室温后，在无菌操作条件下，用灭菌的移液管分别加20 μL接种液，混匀，加塞，在 37℃培养箱培养20～40 h，直至获得最大混浊度。另准备一支S1管不接种作为0对照管。

2.3.1.5 测定

将培养后的测定系列管混匀，用1 cm厚度的比色杯，波长540 nm，以0对照管调节吸光度值为0，依次测定标准系列管和样品系列管的吸光度值。若有以下情况时，说明存在污染，需重做试验：

0对照管有明显细菌增长，混浊；

与0对照管相比，标准0管吸光度值在0.1以上；

标准系列管吸光度值最大变化量<0.4。

2.3.1.6 结果计算

标准曲线：以标准系列管叶酸含量为横坐标，每个标准点的吸光度值平均值为纵坐标，绘制标准曲线。

样品结果计算：从标准曲线查得样品系列管的叶酸对应含量，按公式计算结果(详见标准)。

2.3.2 试剂盒法

2.3.2.1 样品制备

称取1 g维生素胶囊内容物到500 mL离心管中，加入约400 mL磷酸盐缓冲液(7.8 g磷酸二氢钠和1 g抗坏血酸钠溶解于1L蒸馏水中，校正pH值至7.2；每天新配缓冲液)，摇匀。95℃水浴提取30 min，其间振荡至少5次，迅速冷却到30℃以下。将提取溶液全部加入到1000 mL容量瓶中，用无菌水准确定容至刻度。取1 mL溶液至一个50 mL无菌试管中，加无菌水精确至40 mL。然后摇匀，无菌过滤，根据浓度范围，确定是否在1.5 mL(或2.0 mL)无菌试管中进一步稀释。

2.3.2.2 标准品溶液制备

打开试剂盒中的叶酸标准品瓶，添加X mL(X=详见标准品瓶)无菌水(取自试剂盒)至标准品瓶中。盖上标准品瓶盖，摇匀稀释=标准品浓缩液。取6个无菌管(1.5～2.0 mL)，并按照表2准备标准品溶液。

表2 标准曲线溶液制备(试剂盒法)

注：*样品提取稀释倍数 1∶40 已经包含在标准曲线中。

2.3.2.3 培养基制备

取出试剂盒中的培养基，打开瓶盖用镊子取出干燥剂，加入10 mL无菌水(取自试剂盒)至叶酸培养基瓶中，加入1 mL叶酸缓冲液至培养基瓶。盖好培养基瓶，摇匀。水浴加热该瓶至95℃保持5 min，其间振荡至少2次，并确保瓶子封闭。迅速冷却至室温。使用0.22 μm无菌滤膜过滤培养基至15 mL无菌离心管中。

2.3.2.4 培养

微孔板实验中必须使用无菌水稀释的无菌样品，无菌水取自试剂盒。

移液器先移取培养基，之后标准品或稀释的样品，如下：

-移取150 μL叶酸培养基至微孔中。

-移取150 μL标准品或稀释的样品至指定的微孔中(用标准品或样品溶液冲洗移液器尖)。

-用粘合箔盖住板条或微孔，用手将粘合箔平压，使其充分封闭微孔板条。

-在 37℃黑暗条件下孵育44～48 h。

2.3.2.5 测定

再次压紧粘合箔，将微孔板翻置在桌面上，在桌面平面上振荡，使微生物溶解在培养基中。

将微孔板翻回如前置于桌面上，从右上角开始以对角线方向180°角轻扯下粘合箔，与此同时务必用另一只手按住放置在桌面上的微孔板，以防止因粘合箔与微孔板粘合过紧而在撕扯时带起微孔板。破坏微孔中液体表面的所有泡沫(可以用移液管尖或针状物)。

用酶标仪610～630 nm(或540～550 nm)条件下读取吸光度。

判定检测结果有效：

-OD空白值

-OD标准5>0.6 OD。

2.3.2.6 计算结果

计算结果时使用拜发公司提供的配套的RIDA®SOFT Win软件。

样品稀释倍数40已经包括在标准曲线中。在下面的公式中，只需要考虑提取的进一步稀释倍数及不同的样品重量。

3 结果比对

3.1 标准曲线

两个方法均是以叶酸含量为横坐标，吸光度值平均值为纵坐标，绘制标准曲线。国标法(GB 5009.211-2014)试验标准曲线采用EXCEL软件绘制多项式曲线，曲线及方程如图1，决定系数R2=0.998；试剂盒法试验标准曲线采用RIDA®SOFT Win软件生成，如图2，相关系数=0.9995。

图1 标准曲线(国标法)

图2 标准曲线(试剂盒法)

3.2 结果重复性

选取3种已知叶酸含量范围的维生素胶囊A、B、C，取胶囊内容物依2.3.1.1和2.3.2.1分别平行制备6份样品溶液，测定样品溶液中叶酸的浓度，以所得的样品中叶酸的浓度来计算RSD，RSD应≤4%。

所得结果如表3。

表3 两种方法试验结果重复性比对

3.3 加标回收率

取维生素胶囊A、B、C的内容物各12份，每6份同一样品为一组，分为Ⅰ、Ⅱ组。Ⅰ组按国标法测试，Ⅱ组按试剂盒法测试。

AⅠ组：6份样品均同法处理，方法为：于样品中加入161 μg叶酸标准品(配制浓度为1.009 mg/mL的叶酸标准品溶液，加入此溶液160 μL，即加入相当于161 μg叶酸对照品)，摇匀，依2.3.1.1处理，作为供试品溶液A。按2.3.1所述测试，计算回收率和RSD。

AⅡ组：6份样品均同法处理，方法为：于样品中加入283 μg叶酸标准品(配制浓度为1.009 mg/mL的叶酸标准品溶液，加入此溶液280 μL，即加入相当于283 μg叶酸对照品)，摇匀，依2.3.2.1处理，作为供试品溶液B。按2.3.2所述测定，计算回收率和RSD。

BⅠ组：6份样品均同法处理，方法为：于样品中加入151 μg叶酸标准品(配制浓度为1.009 mg/mL的叶酸标准品溶液，加入此溶液150 μL，即加入相当于151 μg叶酸对照品)，摇匀，依2.3.1.1处理，作为供试品溶液A。按2.3.1所述测试，计算回收率和RSD。

BⅡ组：6份样品均同法处理，方法为：于样品中加入212 μg叶酸标准品(配制浓度为1.009 mg/mL的叶酸标准品溶液，加入此溶液210 μL，即加入相当于212 μg叶酸对照品)，摇匀，依2.3.2.1处理，作为供试品溶液B。按2.3.2所述测定，计算回收率和RSD。

CⅠ组：6份样品均同法处理，方法为：于样品中加入60.5 μg叶酸标准品(配制浓度为1.009 mg/mL的叶酸标准品溶液，加入此溶液60 μL，即加入相当于60.5 μg叶酸对照品)，摇匀，依2.3.1.1处理，作为供试品溶液A。按2.3.1所述测试，计算回收率和RSD。

CⅡ组：6份样品均同法处理，方法为：于样品中加入111 μg叶酸标准品(配制浓度为1.009 mg/mL的叶酸标准品溶液，加入此溶液110 μL，即加入相当于111 μg叶酸对照品)，摇匀，依2.3.2.1处理，作为供试品溶液B。按2.3.2所述测定，计算回收率和RSD。

回收率应为85%～110%，RSD应≤4%。

备注：

样品所含叶酸质量=样品依对应的测试方法测得的叶酸平均值(见表5)×取样量(g)

测得加入叶酸质量=测得总叶酸质量-样品所含叶酸质量

回收率=测得加入叶酸的质量÷加入叶酸的质量×100%

所得结果如表4。

表4 两种方法加标回收率测试结果

4 结论

在本次针对维生素胶囊叶酸含量的方法比对中，从测试结果可看出，国标法和试剂盒法的重复性均良好，相对标准偏差(RSD)均≤4%。在精密度上，国标法的回收率在100%～105%，RSD在2%～4%，符合要求(回收率85%～110%，RSD≤4%)；试剂盒法AⅡ、CⅡ组符合要求，BⅡ组回收率仅78.5%，RSD>4%，超出要求范围；Ⅰ组(国标法)的回收率均高于Ⅱ组(试剂盒法)。结果显示，国标法比试剂盒法更适合检测维生素胶囊叶酸含量。

结合实验过程的观察(维生素胶囊B内容物按试剂盒法制备的样品液溶解情况较差)，推测可能是国标法的样品制备方法相比试剂盒法的样品制备方法更适合该胶囊。

此外，在实验过程中，试剂盒法相比国标法，无需活化菌种，培养基用量少，步骤简单，污染概率低，是比较方便快捷的微生物法；国标法从菌种活化到测吸光度值所需时间周期长，易受杂菌或杂质影响。或可尝试将国标法的样品制备法与试剂盒法结合测试。

本次比对国标法试验中，采用带盖的一次性试管，发现比使用重复使用的玻璃试管测试结果更稳定，污染概率大大降低。