高环 翟伟卜 孟菁 史金艳 张文蔚 齐放军

摘要丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）级联途径，由三种级次磷酸化的MAPKKK（MAPK kinase kinase）、MAPKK（MAPK kinase）和MAPK蛋白激酶组成，广泛参与植物防御反应的调控。本文利用已发布的陆地棉Gossypium hirsutum L全基因组数据，对其中的MAPK家族基因编码序列进行多序列比对和聚类分析。结果显示，53个GhMAPK大都含有植物MAPK保守的TXY基序，并且能够聚集到AtMAPK的A、B、C、D四个族中。进而利用病毒诱导的基因沉默（virtls-induced gene silencing，VIGS）技术，研究GhMAPK是否参与调控棉花对链格孢Azternaria alternata抗性。链格孢是引起棉花轮纹斑病并导致棉花早衰的主要病原真菌。结果发现，沉默GhMAPK3、GhMAPK7、GhMAPK9及GhMAPKl9的棉花植株，抗病性显著下降，表明这4种Gh-MAPK正调控棉花对链格孢的抗性。进一步利用靶向性沉默策略，验证这4种GhMAPK中各同源基因对棉花链格孢抗性的调控作用。结果显示，仅同源基因GhMAPK36、GhMAPK76、GhMAPK7c、GhMAPK9a、GhMAPK96、GhMAPKl96和GhMAPKl9c参与正调控棉花对链格孢的抗性，而同源基因GhlVIAPK3a、GhIVIAPK7a、ch-MAPK7d和GhlVIAPK19a并不调控棉花对链格孢的抗性。

关键词棉花;丝裂原活化蛋白激酶;病毒诱导基因沉默;链格孢;抗病性

中图分类号：S435.621.2文献标识码：A DOI：10.16688/j.ZWbh.2018175

植物生长过程中常会遭受环境中各类生物和非生物因子的胁迫。植物能够感受和传递这些胁迫信号，并做出相应的响应。丝裂原活化蛋白激酶（mito-gen-activated protein kinase，MAPK）级联途径是参与调控植物抗病、抗逆反应最普遍的信号传导通路之一。MAPK级联途径由三种级次磷酸化的蛋白激酶组成，即MAPKKK、MAPKK和MAPK。植物受到外界环境胁迫时，会迅速产生信号分子激活MAPKKK;MAPKKK再通过磷酸化S/TXXXXXS/T基序激活MAPKK;而MAPKK又通过磷酸化T-X-Y基序中的Thr或Tyr残基激活MAPK。

MAPK位于整个级联的最下游，被激活后可滞留在细胞质，也可进入细胞核后再磷酸化各种底物，调控植物的生长发育以及各种胁迫响应。不少研究报道了MAPK对植物抗病性的调控作用，拟南芥中fig22激活的级联信号通路MEKKl-MKK4/5-MPK3/6在植株对真菌的抗性中起正调控作用，而另一级联信号通路MEKKl-MKKl/2-MPK4起负调控作用。MPK3/MPK6在拟南芥中也可以通过促进植保素的合成来增强植物的抗病性。水稻中的OsMKK3-OsMPK7-OsWRKY30信号通路正调控水稻对白叶枯病的抗性。烟草中的MAPK蛋白激酶NtWIPK和NtSIPK可介导过敏性细胞死亡，从而增强烟草对TMV的抗性。陆地棉中的GhMPK7和GhMPKl6与植物抗病反应相关，GhMPK7参与水杨酸（salicylic acid，SA）介导的植物广谱抗病性。异源表达GhMPKl6可增强拟南芥对链格孢和青枯假单胞菌Pseudo-monas solanacearum的抗性。

棉花是重要的经济作物，是世界范围内天然纤维的主要来源。近年来，棉花早衰在我国棉花种植区大面积发生，严重影响了棉花的产量和品质。棉花早衰总会伴随棉花轮纹斑病的发生。李莎等从棉花早衰叶片的病斑中分离到引起棉花轮纹斑病的链格孢Alternariaalternata。Zhao Jingqing等、齐放军等研究揭示了棉花早衰与轮纹斑病问的内在联系，总结出我国棉花早衰发生的关键成因：生长中后期，在低温、营养缺乏等因素的作用下，棉花抗病性下降，易于遭受链格孢菌侵染，引起轮纹斑病发生，并最终导致棉花早衰。因此，增强棉花对链格孢的抗性有利于防控棉花早衰。本文利用病毒诱导的基因沉默（VIGS）技术，研究了陆地棉MAPK对链格孢抗性的调控作用。

1材料與方法

1.1试验材料

棉花材料‘新陆早13号和链格孢菌株Alter-naria alternata A1为本实验室保存;用于VIGS试验的棉花叶皱缩病毒Cotton lea f crumple virus，CLCrV沉默载体pCLCrVA和pCLCrVB由本所周雪平教授馈赠;pMDl8-T载体购自TaKaRa大连公司;大肠杆菌E.coli DH5a购于全式金（北京）生物有限公司。

1.2陆地棉MAPK基因家族的筛选及信息收集

陆地棉的全基因组信息来自网站（http：∥mascotton.njau.edu.cn/），在其主页面的Data菜单中获得全基因组的注释信息、CDS序列及其编码的蛋白序列。依据其功能注释，筛选出陆地棉MAPK家族的基因。同时，从拟南芥信息资源数据库TAIR（https：∥WWW.arabidopsis.org/）主页面中获取拟南芥MAPK基因的CDS序列及其编码的蛋白序列。

1.3陆地棉MAPK基因家族的多序列比对和系统进化分析

利用MEGA 6.06（molecular evolutionary ge-netics analysis）软件中的ClustalW功能对所有陆地棉MAPK的蛋白序列进行多序列比对，设置参数为默认。并利用MEGA 6.06中的邻接法（neighbor-joining）将陆地棉MAPK蛋白编码序列和拟南芥Arabidopsis thaliana L.MAPK蛋白编码序列一起进行了系统进化树的构建，校验参数自举值bootstrap设置为1000次重复，用于检测系统进化树各部分的置信度。

1.4构建沉默棉花MAPK基因的VIGS载体

利用SGN VIGS Tool在线网站（http：∥vigs.solgenomics.net/）选择各GhMAPK基因的靶向性沉默片段。再利用Primer Premier 5软件设计各GhMAPK基因沉默片段的扩增引物，为了更好地沉默目的基因，其沉默片段长度尽量控制在300～500bp范围内，设计的引物由上海Invitrogen公司合成。引物信息见表1。