胡媛媛，蔡贤雷，梅琨，王斯妤，Randy A Dahlgren,3*

(1.温州医科大学 浙南水科学研究院，浙江 温州 325035； 2.浙江省流域水环境与健康风险研究重点实验室，浙江 温州 325035；3.加州大学戴维斯分校 陆地、大气与水资源系，美国 戴维斯 CA 95616)

平原河网地区河流纵横交错，人们往往沿河而居，居民的生产生活与水密切相关。伴随着经济的快速发展和城市化进程的加快，平原河网地区水体纳污量不断增加，尤其是含氮物质的大量流入，使河网水体的氮成为主要污染物之一，其污染与防治问题越来越受到广泛关注。近些年来，水体中分布广泛、代谢活跃的各类微生物成为研究的热点[1]。研究表明，微生物在有机物的降解、生源要素的形态转化和地球化学循环等方面发挥重要作用[2]，其中，自然界中氮的循环主要靠微生物驱动，比如氨氧化微生物可以驱动氨氧化反应将水体中的氨氮氧化为亚硝氮，该反应是硝化作用的第一步和限速步骤[3]，对河网水体中氮的消除和下游水体富营养化的控制具有重要作用。氨氧化反应中发挥关键作用的是amoA基因编码的功能酶——氨单加氧酶(ammonia monooxygenase, AMO)，其中的α亚基可以将NH3氧化成NH2OH[4-5]。近几年来，有大量关于具有amoA基因的氨氧化细菌(AOB)和氨氧化古菌(AOA)的研究[6-10]。相关研究表明，AOB和AOA在不同环境中均有发现，且与不同环境因子呈现不同的相关关系，如pH值、营养盐、温度、盐度等[11-12]。

水环境中的微生物，根据其生活方式的不同，可分为附着微生物和浮游微生物。而水体中的悬浮颗粒物作为水中微生物呼吸的热点，其表面的附着微生物是有机质降解、营养素循环过程中重要而直接的参与者[13]。因此，在平原河网这种严重富营养化、大型水生生物消亡的水环境中，对颗粒附着和浮游微生物中的氨氧化微生物进行研究，可以使我们对平原河网的氮循环过程、生态系统结构和功能的变化有更好的了解[14]。

温瑞塘河作为典型的南方平原河网，为温州市人口、经济和污染的聚集地，由于生活和工业污水的大量进入，导致其水环境问题日益突出[15-17]。舜岙河发源于山涧溪流，随后流经村民生活聚集区，最后汇入河网，是温瑞塘河一条典型的入河支流。在本研究中，我们以舜岙河为例，探究平原河网典型入河支流中AOB和AOA在颗粒附着与浮游微生物中的分布情况，并通过多元分析探究氨氧化微生物与环境因子的关系，这对深入了解平原河网氮循环过程、生态系统具有重要意义。

1 材料与方法

1.1 研究区概况与样品采集

采样点位于浙江省温州市温瑞塘河茶山段的舜岙河(27°55′N，120°42′E)。该河源头来自大罗山山涧溪流。上游水体为溪流形式，水浅、清澈，两边有村民种植的杨梅；沿上游往下为人为改造的几个水潭，经常有村民在此进行洗衣、擦车等活动；向下进入舜岙村居民区，两岸均为民房；最后下游汇入平原河网，水面随河道逐渐宽阔。我们从上游到下游依次随机选取12个点作为采样点，分别标记为S1、S2、S3、S4、S5、S6、S7、S8、S9、S10、S11和S12(图1)。其中，S1～S3分布于上游溪流形式的河道中，S4～S6分布于人为改造的水潭中，S7～S9分布于流经居民区的河道中，S10～S12分布于下游汇入平原河网的河道中。于2017年4月11日，用采水器采集表层水样，用多参数水质测定仪YSI现场测定pH、水温(T)、溶解氧(DO)、电导率(EC)等指标。水样冷藏于保温箱中1 h内运回实验室进行后续分析。水体颗粒附着与浮游菌参照文献[18-19]的膜过滤方法进行分离与获取，经5 μm孔径聚碳酸酯膜过滤，截留在滤膜上的微生物为颗粒附着菌；经5 μm孔径聚碳酸酯膜过滤的水样，再经0.2 μm孔径聚碳酸酯膜过滤截留的为浮游菌。收集的样品-20 ℃保存，用于后续的DNA提取和定量PCR分析。同时，样品过滤之前，取10 mL水样，5 μm孔径聚碳酸酯膜过滤后再取10 mL过滤水样，分别加入无颗粒甲醛(预先用0.2 μm滤膜过滤的分析纯甲醛)进行固定，使甲醛的终浓度≥2%，样品-4 ℃冷藏，分别用于后续总菌与浮游菌的计数，并通过总菌减去浮游菌获得颗粒附着菌数目。

图1 研究点位的分布

1.2 指标测定方法

1.2.1 水化学指标的测定

1.2.2 细菌计数

取无颗粒甲醛固定的样品，加入DAPI溶液(终浓度为1 μg·mL-1)，染色10 min后，采用手持式过滤泵，在真空压力小于10 mm Hg下，过滤至孔径为0.2 μm的黑背景聚碳酸酯膜上，滴加无荧光镜油，于荧光显微镜(DM 4000B, Leica)100倍油镜下对总菌和浮游菌进行计数[21-22]。在紫外光的激发下，每个样本随机取20个视野计数。

1.2.3 DNA的提取与qPCR

采用FastDNA®Spin Kit for Soil对样品进行DNA提取，提取方法参照该试剂盒所提供的说明书进行。参考Zeng等[23]的方法，分别以amoA-1F和amoA-2R[8]、Arch-amoAF和Arch-amoAR[10]为引物对氨氧化细菌amoA基因片段(491 bp)、氨氧化古菌的amoA基因片段(635 bp)进行扩增。分别以10倍梯度稀释各重组质粒，得到各自的标准曲线，从而根据qPCR结果计算出相应的拷贝数。阴性对照、样品和质粒均为3个重复，qPCR的体系为20 μL∶10 μL 2×TransStart®Top Green qPCR Super Mix，上下游引物各0.4 μL，0.4 μL Passive Reference Dye(50×)，8.4 μL ddH2O，0.4 μL DNA模板。

1.3 数据分析

采用SPSS 20.0对数据进行方差分析(one way ANOVA)和Duncan多重对比。图表由Excel和Origin 8.0软件进行绘制。采用CANOCO 4.5软件进行主成分分析(PCA)和冗余分析(RDA)。

2 结果与分析

2.1 水样的基本理化性质

表1 不同位点的水环境状况

2.2 细菌计数与amoA基因丰度

12个位点中浮游态细菌丰度与附着态细菌丰度存在显著差异(P<0.05)，浮游态细菌的丰度多于附着态细菌(图2)。从浮游态和附着态微生物群体中AOB和AOA功能基因拷贝数均值来看，浮游细菌中AOB和附着细菌中AOB的丰度无显著差异，浮游AOB丰度略高于附着AOB丰度，AOB丰度总体来说高于AOA。而浮游AOA丰度显著(P<0.05)高于颗粒附着态AOA。

图2 不同微生物丰度对比

2.3 氨氧化微生物丰度与环境因子之间的关系

将所得到的环境因子做主成分分析(PCA)，结果见图3。图中样点之间的远近反映出不同点位水环境状况的相异程度，点越近代表其环境因子的相似性越高，根据在PCA图中的排序结果，大致可以得到4个分组，分别为S1～S3、S4～S6、S7～S9和S10～S12，分组情况与周边环境的功能区大致吻合。而通过氨氧化微生物丰度进行RDA分析，可以发现12个样点同样可以得到4个分组，与PCA结果相似。另外，通过RDA分析，可知总氮、氨氮、TOC对氨氧化微生物的丰度有较强的作用。

图3 环境因子分布PCA分析与氨氧化微生物分布的RDA分析

3 小结与讨论

采样研究结果表明，受不同功能区影响舜岙河各处的水质状况差异显著，从上游到下游水体有机污染逐渐加重。通过对水体微生物丰度进行测定，发现在非汛期，浮游态微生物丰度显著高于颗粒附着态微生物丰度，浮游态氨氧化微生物丰度高于颗粒附着态氨氧化微生物丰度，其中氨氧化细菌丰度高于氨氧化古菌。经PCA和RDA分析发现，环境因子对氨氧化微生物丰度和分布存在影响，其中总氮、氨氮、TOC是影响氨氧化微生物丰度和分布的主要环境因子。

微生物在不同环境中如海洋[24-25]、大型富营养化淡水湖[26-28]等典型生态环境的研究有很多，有结果表明，微生物的数量会随着水中营养程度的递增而升高[29]，因此，水中微生物的数量分布与动力学转换紧密体现着水体水质的状况。黄瑾[30]在对太湖的研究发现，浮游态细菌丰度和多样性的主要环境影响因子为氨氮、硝态氮和TSS等，在河口等营养程度较高的地区细菌丰度最高。本次研究的舜岙河是温瑞塘河一条比较典型的入河支流，由于受到周围不同环境的影响，其水质状况呈现一定规律性的变化，水体有机物、氨氮含量呈现增高的趋势，将环境因子进行PCA分析后形成了比较明显的4个分区：其中位于平原河网入口处的S10～S12位点的总氮、氨氮和TOC等指标浓度最高，为该河中营养程度最高的区域，不难推断其原因，即平原河网水体受到沿岸生活、餐厨污物的影响较大，又因其流速较慢、纳污能力较强，使其成为严重富营养化、有机物较多的水环境，因此，一些指标普遍高于流速较快、水浅的上中游区域；其次为流经居民生活区的S7～S9位点；而位于上中游的S1～S3和S4～S6位点处的污染程度较低。通过对微生物的丰度进行测定，发现浮游态和附着态微生物群体的丰度存在显著差异，浮游态微生物丰度普遍高于附着态微生物，虽然采样河道水深较浅，但采样时天气晴朗，山涧来水较少，底泥未见悬浮，水质清澈，SS的测定结果也表明，水体悬浮颗粒物含量较低，尤其在舜岙河的上中游未汇入河网的河道中，因此，颗粒物含量较少可能是本研究中浮游态微生物丰度显著高于附着态微生物的原因。

氨氧化微生物对平原河网水生态平衡、过量氮素的迁移转化发挥着重要的作用。然而，作为氮循环的主要参与者，氨氧化微生物的丰度与分布亦受多种环境因子的影响[31]。研究结果显示，舜岙河中氨氧化细菌受到周围水环境的影响，进行RDA分析后可将12个样品大致划分为4个分组，而这个分组与基于环境因子的PCA分析结果相似，间接表明环境因子的变化对氨氧化微生物的分布具有重要意义。通过RDA分析可知，在本研究中对氨氧化微生物存在主要影响的环境因子为总氮、氨氮和TOC。另外，对比AOB和AOA，发现AOB的丰度显著高于AOA，许多研究表明，AOB的丰度随着氨氮浓度的升高而增加，在氨氮含量较高的生态环境中AOB的丰度高于AOA[32-33]。本次研究中氨氮浓度从上游到下游逐渐升高，在位于居民生活区和汇入平原河网的河口处氨氮浓度较高，可能为AOB提供了适宜的生存环境，而12个位点的pH变化幅度较小，呈弱碱性，也有利于AOB类微生物展现硝化活性，以上原因可能导致在舜岙河中AOB较AOA为优势种群。将氨氧化微生物根据其生活类型分类后发现，无论是浮游态微生物中AOA还是AOB，其丰度均相应的高于附着态微生物中的AOA和AOB，可能原因为研究时该河中浮游态微生物丰度较颗粒附着态微生物高，导致浮游态氨氧化微生物也相应的多于附着态氨氧化微生物。