燕平梅，邢勇，李娜，赵文婧，陈燕飞，乔宏萍

(1.太原师范学院 生物系，太原 030619; 2.土壤消毒活化绿色产业技术创新战略联盟，太原 030619)

榨菜越来越多地出现在人们的餐桌上，它是一种以茎用芥菜为原料腌制而成的半干态非发酵性咸菜，它质地脆嫩、风味鲜美、营养丰富，具有一种特有的风味，具有特殊的酸味和咸鲜味，富含丰富的人体所必需的蛋白质、胡萝卜素、膳食纤维、矿物质等以及谷氨酸、天门冬氨酸、丙氨酸等17种游离氨基酸，可以佐餐、炒菜、做汤，深受人们喜爱。在榨菜腌制过程中，酵母菌发挥了不可或缺的作用，可以将榨菜中的物质分解成人体易吸收的有益物质，通过研究榨菜中酵母菌的多样性可以了解哪些种属发挥的作用较大，然后通过人工添加相关菌种来促进榨菜的腌制。

本实验中，研究榨菜中酵母菌的多样性采用的是非培养的方法即PCR-DGGE技术，如今DGGE技术已经成为研究微生物群落及亲缘关系的主要分子工具之一[1，2]，它具有不需要通过培养就可以进行分析序列的优点，可以大大地缩短样品分析的时间，减少工作量，也已经广泛地应用于食品(包括腌制蔬菜)微生物的研究中[3，4]。DGGE技术是通过聚丙烯酰氨凝胶中变性剂浓度的不同，将不同序列DNA分开，之后通过凝胶成像仪得到DGGE图谱，通过DGGE图谱上的条带[5，6]，达到了解微生物的实验目的，再通过对DGGE图谱的分析，从而了解其种群特征及多样性[7]。

榨菜在我国拥有悠久的加工历史，并且由于其本身爽口的特点以及方便性，越来越深受人们喜爱，通过对榨菜进一步分析得知，不仅食材本身具有特殊性，其中微生物发酵对其口感也有影响，随着对榨菜中微生物群落的多样性研究越来越详细，人们对口感的改善也有了更丰富的经验，其中杨珺等[8]、李正国等[9]、燕平梅等[10]分别通过微生物的分离培养、传统分离培养与DGGE技术结合、PCR-DGGE技术，对榨菜发酵过程中的微生物种类、榨菜腌制过程中的细菌多样性以及榨菜中的乳酸菌群落进行了相关的研究，对细菌等微生物给出了参考。但是由于对榨菜中的真菌研究较少，故为了进一步探索榨菜中的真菌多样性，本文通过PCR-DGGE技术对市售的袋装榨菜进行了研究，进一步了解了榨菜中的真菌(以酵母菌为研究对象)群落的多样性[11]。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 原材料

爽口榨菜400 g，用SZ表示，其成分为：榨菜、食用盐、辣椒、香辛料、食品添加剂(苯甲酸钠、柠檬黄)；

乌江榨菜70 g，用WZ表示，其成分为：榨菜、食用盐、植物油、食品添加剂(谷氨酸钠、5-呈味核苷酸二钠、安赛蜜、乙二胺四乙酸二钠、柠檬酸钠)、辣椒、发酵酱油粉(酿造酱油、麦芽糊精、食用盐)。

1.1.2 主要试剂及仪器

试剂：血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒(离心柱型)、TAE缓冲液、 溴化乙锭、NLI-GC(引物)、 LS2(引物)、琼脂糖(生化试剂)、无菌水、PCR Master Mix、丙烯酰胺、TAE buffer、TEMED、去离子甲酰胺、过硫酸铵、尿素、凝胶加样缓冲液、氢氧化钠、甲醛、冰醋酸、无水乙醇、硝酸银。

仪器：离心机、超净工作台、PCR仪、凝胶成像系统、DYY-6C型电泳仪、电泳槽、紫外分光光度计 美国Bio-Rad公司；无菌手术刀、YXQ-LS-30SⅡ型立式压力蒸汽灭菌器、水浴锅。

1.2 榨菜中微生物的DNA提取

从两种榨菜中各取榨菜汁18 mL于8000 r/min离心5 min，倒掉上清液，将菌种收集到离心管中，然后根据血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒(离心柱型)的说明步骤提取DNA，最后通过琼脂糖凝胶电泳观察提取结果。

1.3 酵母菌的PCR扩增

以酵母菌的DNA为模板，引物为酵母菌的DNA扩增的通用引物(由上海生工生物工程技术服务有限公司合成)：

NL1-GC:cgc ccg ccg cgc ggc ggg cgg ggc ggg ggc gcg ata tca ata agc gga gga aaa g；

LS2:att ccc aaa caa ctc gac tc；

PCR的反应体系为：PCR Master Mix 12.5 μL，NL1-GC 1 μL，LS2 1 μL，无菌水9 μL，样品DNA 1.5 μL。

PCR的反应程序为：94 ℃ 5 min,94 ℃ 30 s,46 ℃ 30 s,72 ℃ 30 s,72 ℃ 5 min,设置30个循环。

PCR结束后，取PCR产物5 μL，通过琼脂糖凝胶电泳，观察DNA电泳结果。

1.4 酵母菌PCR产物变性梯度凝胶电泳(DGGE)

变性梯度凝胶的配方见表1。

表1 变性梯度凝胶的配方Table 1 The formula of denatured gradient gel

DGGE电泳后凝胶于Bio-Rad公司的凝胶成像系统分析、拍照。将每条可看到的电泳带切割回收，溶胶后作为模板通过PCR反应扩增16S rDNA V7-V8片段，纯化后与pGM-T Vector进行连接， 转化感受态细胞。将检测阳性克隆的送至华大基因公司进行基因序列测定。

1.5 DGGE图谱分析

将DGGE电泳片段放入凝胶成像系统中观察并读取图谱，用Quantity One Software 对DGGE图谱中条带的亮度、位置、面积等数据进行分析，并对分析结果的数据进行标准化处理，然后根据Microsoft Excel软件计算多样性指数(H)、均匀度指数(E)及丰富度指数(R)。

其中相关生态指数计算公式为：

H=-∑Pilog2Pi；

E=1-∑Pi2；

R=S-1/InN。

式中：Pi为Relative Qty值/100，N为某一泳道所有峰面积，S为某一泳道的总条带数。

2 结果和分析

2.1 榨菜中微生物DNA提取结果

图1 榨菜中微生物DNA琼脂糖凝胶电泳结果 Fig.1 The result of microbial DNA in pickles by agar gel electrophoresis

注：图中1,2 表示爽口榨菜，3，4表示乌江榨菜。

DNA琼脂糖凝胶电泳结果中，条带表示是否具有DNA，亮度表示其含量的多少。由图1可知，在4个泳道中都有亮点，说明提取到了DNA，但是由于亮度较暗，说明DNA含量较少。

2.2 酵母菌PCR扩增结果

图2中左边第一条条带为marker，其后4条条带为酵母菌DNA，从左往右依次为SZ、SZ、WZ、WZ，根据Marker可知扩增后酵母菌DNA分子量为400 bp，可以进行DGGE分析。

图2 酵母菌DNA PCR扩增电泳图Fig.2 PCR amplification electrophoresis figure of Saccharomycetes DNA

2.3 酵母菌PCR产物变性梯度凝胶电泳

榨菜酵母菌的DGGE电泳图见图3。

图3 DGGE电泳图谱Fig.3 DGGE electrophoresis

图3中SZ为爽口榨菜，WZ为乌江榨菜，图中条带的多少说明酵母菌种群的多样性，不同位置的条带说明酵母菌种属不同，条带的亮度表明酵母菌的丰富度[12，13]。爽口榨菜有两条不同变性浓度的条带，说明爽口榨菜中有两种不同的酵母菌，乌江榨菜中也有两种不同的酵母菌，但是爽口榨菜(SZ)中的第一条条带与乌江榨菜(WZ)中的第一条条带的变性浓度相同，说明这两条条带为同一种酵母菌。

2.4 DGGE图谱结构多样性分析

表1 榨菜中酵母菌多样性分析Table 1 Analysis of the diversity of Saccharomycetes in pickles

由表1可知，样品SZ(即爽口榨菜)中的酵母菌多样性指数与丰富度都比样品WZ(即乌江榨菜)中的数值大，均匀度却比样品WZ小。

2.5 聚类分析结果

图4 样本聚类分析结果Fig.4 Sample cluster analysis results

图4中#1代表SZ，#2代表WZ，#3为空白位置，不带有任何序列，根据聚类分析结果可知，SZ与WZ的相似性为0.60，说明在两种榨菜中，酵母菌的相似性较大。

2.6 基因测序分析结果

表2 DGGE序列测序分析结果Table 2 Sequencing analysis results of DGGE sequences

编号SZ1代表爽口榨菜(SZ)DGGE图谱中的第一条条带，SZ2代表SZ中的第二条条带，WZ2代表乌江榨菜(WZ)中的第二条条带，由DGGE图谱可知WZ中的第一条条带与SZ1的变性浓度相同，可知为同一种酵母菌。由表2可以得出在NCBI中具有最高同源性的菌株，这有助于进一步准确确定其序列所属的菌种，将测序结果使用MEGA 6.0软件进行系统发育树的构建，见图5。

2.7 构建系统发育树

图5 DNA序列系统发育树Fig.5 DNA sequence phylogenetic tree

由图5可知，条带SZ2与条带WZ2有较近的亲缘关系，相似度为93%；SZ2的相似菌种Candidatropicalis与WZ2的相似菌种Saturnisporamendonce的亲缘关系较近，相似度高达98%；条带生长SZ2与条带SZ1亲缘关系较差，相似度只有57%，由系统发育树可知，两种榨菜样品中含有的酵母菌可能与Candidatropicalis，Pichiafermentans，Saturnisporamendonce这3种菌有较高的相似性。

3 讨论

榨菜作为一种非发酵腌制食品，其中微生物种类丰富，越来越多的学者对其进行了深入研究，杨珺等在《四川榨菜后熟时期微生物区系的研究》中探索了其中细菌及真菌的优势种类，得出酵母菌有5个属，具体确定到种时为3种酵母菌，但是采用的方法为培养的方法，相对于本实验采用的PCR-DGGE非培养方法较为麻烦，本实验通过PCR-DGGE技术分析序列直接得知样品中酵母菌的种类。随后学者李正国对于研究榨菜中微生物多样性的方法进行了前沿性探索，实验采用培养方式及PCR-DGGE技术相结合的方法，得到了榨菜发酵中的优势细菌为明串珠菌属，其次为乳酸菌，虽然研究方法有了突破，但是研究的只是榨菜中细菌种类的多样性，没有涉及到真菌的研究，本文在其基础上发展到对真菌的研究，在方法上只采用非培养PCR-DGGE技术进行研究[14]，本文以两种市售榨菜为研究对象，对榨菜中的酵母菌多样性进行了探索，由DGGE图谱分析可知，酵母菌的种类含量较多，对于榨菜具有举足轻重的作用。而DGGE技术检测极限低，并且可以同时快速分析多个样品，能清楚、准确地反映样品间微生物群落的差异性及其多样性，并且可以将条带切割下来测序，可以说这是分析微生物群落多样性及其差异性最为广泛的工具之一[15]。本文得出的酵母菌种类与杨珺等人分析得出的酵母菌种类不同，不仅由于其样本不同，可能还与DGGE分析有关，根据DGGE技术的原理可知，在同一位置上DNA序列是相同的，但是，由于异源双链体[16]、嵌合体、共迁移等会导致结果产生偏差。在实验操作中还应认真仔细，减少其不必要的误差，如：DGGE电泳过程中的染色，应采用效果好且不与其他物质相影响的染色剂；还有在使用Quantity One软件时应尽量减少偏差的出现，使其可以准确地体现出条带的信息，这样做出的实验及得出的结论才可以有更高的精确性及说服力。所以可以采用其他方法，如原位杂交、克隆、分离培养等技术相结合使用进行分析，这样可以提高实验的准确性[17]。