张茜茜，朱慧明，杨肖静，黄志伟 ，龚梦馨，张志强 ，牛津徽，杨洪江

(1.天津科技大学生物工程学院 工业微生物教育部重点实验室 天津市工业微生物重点实验室，天津 300457；2.北京化工大学生命科学与技术学院，北京 100029)

【研究意义】细菌和真菌产生的铁载体，是一类对Fe3+具有较高亲和力的小分子金属离子螯合物(500～1500 daltons)，主要功能是为细胞提供铁营养成分[1]。铁载体根据官能团的不同主要分为氧肟酸型、儿茶酚型和柠檬酸型3类[2]；而根据铁载体的结构进行分类，主要分为线性结构和环状结构。尽管铁载体之间存在很多的差异，但多数借助带负电荷的氧原子与Fe3+结合，6个配体与1个Fe3+形成最常见的六面体或八面体结构[3]。随着研究的深入，大量铁载体的相似物被发现，如与ferrioxamines结构相似的铁载体就高达20种[4]。这些类似物的不同之处在于侧链上的短肽，这些多肽为Fe3+结合提供了最适的结合位点，同时还保护铁载体免受水解酶的破坏作用。【前人研究进展】铁载体一方面为生物提供铁营养成分，维持微生物的正常生长；另一方面，某些铁载体不仅能螯合Fe3+，还能与Al3+、Co2+、Pb2+和Cu2+等金属离子结合[5]。铁载体(desferrioxamine, DFOB)在高pH值下，与钴离子的螯合能力大于铁离子，在对矿山废弃物或者金属污染的土壤进行生物修复时，可以使用铁载体清理重金属离子，对于环境的生物修复具有重要应用价值[6]。东方拟无枝酸菌Amycolatopsisorientalis产生的铁载体乙二胺二琥珀酸(ethylene diaMino-disuccinic acid, EDDS)以及根瘤菌Rhizobiummeliloti产生的铁载体rhizobactin，被认为是天然的生物可降解的APCAs(aminopolycarboxylic chelating agents)型螯合剂，能够替代合成螯合剂，与不同金属形成络合物，同时不污染环境，是一种经济且环境友好的技术[7]。【本研究切入点】本实验室分离了一株产铁载体的枯草芽孢杆菌MB8[8]，本研究拟对MB8合成铁载体的培养条件、铁载体的类型及分子结构、铁载体的抗氧化作用以及促进不溶性针铁矿溶解的功能等方面进行分析。【拟解决的关键问题】旨为枯草芽孢杆菌MB8的可能应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 供试材料

1.1.1 菌株 枯草芽孢杆菌B.subtilisMB8分离自鸡粪样品中，具有合成铁载体的能力[8]。

1.1.2 培养基 LB(Luria-Bertani)培养基主要用于细菌的常规培养，MKB(Modified King B)培养基主要用于对常见致病菌的培养，察氏培养基(Czapek Dox Medium)主要用于霉菌的培养。AM(Arginine Medium)培养基[9]主要用于培养菌株产生铁载体，成分为K2SO41 g/L、CH3COONH43 g/L、MgSO40.8 g/L、ZnSO40.0086 g/L、MnSO40.113×10-3g/L、葡萄糖20 g/L、精氨酸1.5 g/L、Na2HPO43 g/L，调pH至7.0。

1.1.3 溶液 CAS(Chrome Azurol S)溶液[10]主要用于检测铁载体，成分为铬天青S 1.21 g/L、十六烷基三甲基溴化铵(Hexadecyl trimethyl ammonium Bromide, HDTMA)1.82 g/L、FeCl3(溶于10 mmol/L HCl)0.27 g/L、无水哌嗪30.24 g/L，调pH至5.6。Arnow试剂主要用于检测儿茶酚型铁载体，成分为0.5 mol/L HCl、1 mol/L NaOH、10 g钼酸钠和10 g亚硝酸钠，溶解于部分去离子水中，待完全溶解后体积补至100 mL[11]。1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)溶液，含有400 μmol/L DPPH，溶于80 %的无水甲醇。

1.2 试验方法

1.2.1 正交设计 为了确定最佳铁载体产生条件，选取甘油、精氨酸、接种量这3个因素，以铁载体产量SU为指标，设计正交实验[12]，实验因素水平见表1。

(1)

式中，Ar是未接种的培养基与等体积CAS混合后的OD680，As是菌株上清与等体积CAS混合后的OD680。

1.2.2 金属离子对铁载体产量的研究 2,3-二羟基苯甲酸标准曲线的绘制。为了定量分析菌株MB8产生的儿茶酚型铁载体的含量，分别配置0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9和1.0 g/L的2,3-二羟基苯甲酸(2,3-dihydroxy-benzoic acid, DHBA)标准溶液，Arnow试剂检测，以OD510的吸光度值为纵坐标，以DHBA的浓度为横坐标，绘制DHBA标准曲线。

Fe3+对菌株铁载体产量的影响。在培养基中添加Fe3+，使Fe3+的终浓度分别为0、0.1、0.5、1.0 μmol/L，36 h后测定菌株的生物量OD600和铁载体产量，同时取1 mL菌液梯度稀释涂板计数。

Al3+对菌株铁载体产量的影响。为了比较铁载体对Fe3+和Al3+的螯合能力，将常规的CAS溶液中的Fe3+用等体积等浓度的Al3+替代，然后取1 mL菌株MB8的无细胞上清液与2种CAS溶液混合，室温下静置1 h后测定OD680，以培养基为阴性对照；在培养基中添加Al3+，使其Al3+的终浓度分别为0、20、50和100 μmol/L，36 h后测定菌株的生物量OD600和铁载体产量，同时取1 mL菌液梯度稀释涂板计数。

Cu2+对铁载体产量的研究。在培养基分别添加终浓度为0、20、50和100 μmol/L的Cu2+，36 h后测定菌株的生物量OD600和铁载体产量，同时取1 mL菌液梯度稀释涂板计数。

1.2.3 铁载体对不溶性针铁矿的溶解研究 不溶性针铁矿(goethite)的制备。将180 mL 氢氧化钾(5 mol/L)加入到100 mL硝酸铁(1 mol/L)溶液中，迅速加入去离子水至体积为2 L，70 ℃下加热60 h，待冷却至室温后去离子水洗涤至上清pH值为中性，真空冷冻干燥12 h后得到土黄色粉末状物质，使用将其前加入到三角瓶中，121 ℃灭菌20 min[13]。

表1 正交实验设计各因素及水平Table 1 Orthogonal experimental design of various factors and levels

铁载体对不溶性针铁矿的溶解利用。菌株MB8在终浓度为0和100 μmol/L Fe3+的培养基中培养36 h后，发酵液经离心过滤后，在每个已分装有3 mg自制无菌针铁矿(goethite)的三角瓶中加入30 mL不同铁载体含量的无细胞滤液，30 ℃、150 r/min培养，每隔12 h取出1瓶，10 000 r/min离心5 min除去不溶的针铁矿，-80 ℃下预冻24 h，真空冷冻干燥12 h，加入15 mL纯净水，充分溶解后，利用原子吸收分光光度法测定溶液中铁的含量[14]。

1.2.4 铁载体结构的初步鉴定 铁载体的溶剂萃取。10 000 r/min离心菌株MB8发酵液10 min，10 kD截留量的聚砜中空纤维柱超滤，滤液用6 mol/L HCl调pH值为2.0，用1/2体积的乙酸乙酯萃取3次，弃水相保留有机相，0.1个真空度30 ℃旋蒸，沉淀溶于无水甲醇，0.22 μm有机滤膜过滤后4 ℃下保存[15]，为铁载体粗提液。

液质联用对铁载体结构进行初步分析。①全波长扫描 对含有铁载体的溶液进行全波长扫描，确定菌株MB8铁载体的吸收波长。②HPLC-ESI-MS。将上述得到的菌株MB8铁载体粗提液进行高效液相色谱检测，条件设置分别为：色谱柱类型：Phenomenex Luna C18(5 μm)；流动相：5 %乙腈(0.1 %甲酸)-100 %乙腈(0.1 %甲酸)；柱温：25 ℃；离子源：ESI；离子极性：负离子；扫描范围：100 ℃1 000 m/z。③UPLC-ESI-MS/MS。利用Waters UPLC-Quattro Premier XE三重四级杆液质联用仪对菌株MB8产生的儿茶酚型铁载体进行进一步的分析，该仪器配有Waters ACQUITY UPLC®BEH C18(1.7 μm，2.1100 mm柱子)，一级质谱的扫描范围是100～1000 m/z，二级质谱的扫描范围是50～950 m/z，二级质谱碰撞能量为10、20、30和40 V。

1.2.5 铁载体抗氧化作用的研究 铁载体具有的抗氧化能力通过对DPPH自由基清除能力来表示，对DPPH的清除能力越大，说明儿茶酚型铁载体的抗氧化能力越强。菌株分别在含有0 和100 μmol/L Fe3+浓度的培养基中培养36 h，铁载体产量SU分别为91.99 %和1.01 %，发酵液经酸化和乙酸乙酯萃取处理，得到的溶液旋蒸至干，甲醇溶解后，稀释1000倍后取不同体积(0、0.2、0.4、0.6、0.8和1 mL)于试管中，补加甲醇至2 mL，然后再分别添加2 mL DPPH溶液，避光室温下反应30 min后测定517 nm处的吸光度值[16]。

(2)

式中，A1：样品和DPPH混合30 min后的OD517；A2：甲醇和DPPH混合30 min后的OD517；A3：样品和甲醇混合30 min后的OD517。

2 结果与分析

2.1 菌株MB8分泌铁载体条件的优化

选取甘油、精氨酸、接种量为单因素，选用L9(34)正交表安排实验。根据表2的极差分析结果可以看出，对MB8铁载体产量影响的主次顺序是甘油>接种量>精氨酸；从表3的正交结果方差分析显示，区间组F=2.56，概率P= 0.1480 >α=0.05，说明区间组差异不显著，即可不考虑因素之间的交互作用；A(甘油)因素F= 19.32，概率P= 0.0009 <α =0.01说明甘油浓度对铁载体产量的影响极为显著；B(精氨酸浓度)因素F= 0.99，概率P=0.4129 >α =0.05，说明B精氨酸浓度的改变对菌株铁载体产量影响不显著；C因素F= 4.37，概率P= 0.0522>α =0.01，略大于α =0.05，说明接种量对菌株铁载体产量影响微显著。综上可得最优的培养条件为甘油浓度4 %(mL/L)，精氨酸浓度1.5 g/L，其余成分保持不变，接种量为7 %。

表2 L9(34) 铁载体产量正交实验结果Table 2 Orthogonal experiment results of siderophore-production

表3 正交实验方差分析Table 3 ANOVA of orthogonal experiment

2.2 金属离子对铁载体产量的影响

为了定量分析儿茶酚型铁载体的含量，按照Arnow方法检测不同浓度的2,3-二羟基苯甲酸(2, 3-dihydroxy-benzoic acid, DHBA)标准溶液，获得DHBA的标准曲线，如图1所示。根据上述求得的方程式，经过培养基成分和发酵参数的优化，MB8产生的儿茶酚型铁载体量OD510= 1.991，相当于DHBA标品的浓度为0.117 g/L。

Al3+是一种常见的三价金属元素，与Fe3+具有相似的离子半径，当用等体积等浓度的Al3+代替常规CAS溶液中的Fe3+，全波长扫描蓝色CAS-Al3+-CTAB络合物，发现CAS-Al3+-CTAB络合物的特异吸收波长依然在680 nm处。取等体积上清与2种CAS溶液混合，室温下静置反应1 h，发现混合液中CAS-Al3+-CTAB浓度大于CAS-Fe3+-CTAB，也就是说MB8产生的铁载体在相同浓度和相同时间内，从CAS-Al3+-CTAB中竞争螯合Al3+的能力要小于从CAS-Fe3+-CTAB中竞争螯合Fe3+的能力。

图1 2,3-二羟基苯甲酸标准曲线Fig.1 Standard curve of 2,3-dihydroxy-benzoic acid

如图2(A)所示，当菌株MB8在含有不同浓度的Al3+培养基中生长时，菌株生物量无显著差异，但每个细胞产生的铁载体产量 显著增加，与对照(0 μmol/L Al3+)相比，Al3+浓度分别为20、50和100 μmol/L，儿茶酚型铁载体产量相应提高了24.66 %、34.15 %和34.40 %。针对这种现象最可能的解释就是当Al3+与铁载体结合后，生物不能获得足够的铁营养满足自身的生长，被迫产生更多的铁载体来获得铁元素。

除此之外，菌株的铁载体产量还受到二价金属离子的影响。如图2(B)所示，适量的Cu2+对MB8的生长有促进作用，当浓度增加到100 μmol/L时，菌株生物量出现明显下降，但每个细胞的铁载体产量却没有因Cu2+浓度的变化受到影响，说明在一定的浓度范围内，Cu2+浓度的变化对铁载体产量无显著影响。

2.3 铁载体促进不溶性针铁矿的溶解

在低铁载体含量下，不溶性针铁矿24、36和60 h的溶解度分别是0.019、0.024和0.035 μg/mL，溶解速率分别为0.002、0.002、0.003 μg/(mL·h)；高铁载体含量下，不溶性针铁矿在24、36、48、60、72和84 h的溶解度分别是0.028、0.028、0.111、0.139、0.167和0.223 μg/mL，此时的溶解速率分别是0.002、0.002、0.009、0.012、0.014和0.019 μg/(mL·h)，铁载体的作用使得不溶性针铁矿的溶解速率提高了约6倍。

图2 金属离子对菌株MB8铁载体产量的影响Fig.2 Effect of metal ion on siderophore-production of MB8 strain

2.4 色谱分析铁载体结构

分别对标品2,3-羟基苯甲酸(2,3-DHBA)、乙酸乙酯萃取后的水相样品和有机相样品，进行全波长扫描，根据扫描结果选择245 和315 nm作为吸收波长。初步分离后的发酵液经过高压液相分离，在色谱图上出现多个峰，其中保留时间为13.320 min的峰(图3)与标品2,3-DHBA的保留时间为13.420 min相近，所以，铁载体粗提液中可能含有DHBA。

2.5 ESI离子源负离子模式质谱仪分析铁载体的结构

将高压液相制备的物质依次加入ESI离子源负离子模式质谱仪中，如图4所示，液相中保留时间11.48，13.18、13.30和14.55 min对应的质荷比(m/z)为311、605、153和881，分别与[(DHBA-Gly-Thr)-H]-、[(DHBA-Gly-Thr)2-H]-、[DHBA-H]-和[(DHBA-Gly-Thr)3-H]-一致。

2.6 UPLC-ESI-MS/MS质谱仪分析铁载体结构

为了确认菌株MB8合成铁载体的结构，选取质荷比为881 m/z的离子进入UPLC-ESI-MS/MS质谱仪，如图5所示，m/z为881的离子(M)被进一步离子化，出现的碎片质荷比主要有587、293和192，分别与[M-(DHBA-Gly-Thr)-H]-、[M-(DHBA-Gly-Thr)2-H]-和[DHBA+Gly-H]-对应，其中m/z为249是去碳酸基的[DHBA-Gly-Thr-H]-。

综合以上结果，初步推断菌株MB8产生的儿茶酚型铁载体可能与已知的Bacillibactin相似，分子量为882，以中间代谢产物DHBA为前体物质，通过肽键与甘氨酸Gly和苏氨酸Thr结合形成单体，然后单体聚集在一起形成二体或环状三体[17]。

2.7 铁载体的抗氧化作用

Maud等人研究表明沙门氏菌能分泌的儿茶酚型铁载体，且该物质能帮助沙门氏菌应对某些氧化压力[18]。为了确定菌株MB8产生的儿茶酚型铁载体是否具有抗氧化能力，利用对DPPH自由基的清除能力来表示其抗氧化能力。如图6所示，将铁载体产量SU分别为91.99 %和1.01 %的粗提液，分别稀释1000倍后取不同体积后与DPPH溶液避光混合，其中铁载体含量SU为91.99 %的粗提液对DPPH自由的清除能力随着体积的增加逐渐增大，而铁载体含量SU为1.01 %的粗提液对DPPH的清除能力几乎没有变化。

A：标品2,3-二羟基苯甲酸；B：菌株MB8的铁载体粗提液图3 高效液相色谱图Fig.3 High performance liquid chromatogram

A：溶液1在HPLC-ESI-MS的负离子模式下的总离子流图；箭头：指向的是某一质荷比的选择离子流图；B：相应保留时间下物质的质谱图图4 溶液中不同保留时间下的质谱图Fig.4 Mass spectra of the peak with different retention time of sample

3 讨 论

自然界中，细菌通过合成分泌铁载体获取所需的铁元素用于生长，并在各种微生物生态系统中获得竞争优势。芽孢杆菌是重要的革兰氏阳性菌，目前已经从不同环境中分离出多种能够合成铁载体的菌株。例如从文冠果植株根系瘤状物分离获得了能够产铁载体的多株内生细菌，分别属于芽孢杆菌属(Bacillus)和短芽孢杆菌属(Brevibacillus)[19]；从黑麦草根际土壤中分离到1株产铁载体巨大芽孢杆菌BacillusmegateriumLY02，该菌株具有较强的耐镉能力[20]；从花生根际分离筛选出产铁载体芽孢杆菌HSGJ1，对镍离子具有较强耐受性，能够有效促进花生生长，并降低花生根系的镍离子含量[21]；从海南辣椒的根际土壤中分离了产铁载体的枯草芽孢杆菌B.subtilisCAS15，能够有效地促进植株的生长[22]；从炼铁厂土壤中分离了芽孢杆菌Bacillussp. SD12，具有较强的抗真菌活性[23]。短小芽孢杆菌BacilluspumilusToIrMA-KC806242能够合成铁载体，可以作为潜在生物防控因子，抑制番茄枯萎病[24]；从CoffeaarabicaL.根际土壤中分离了芽孢杆菌BT42，能够铁载体，抑制CoffeaarabicaL.的病原菌[25]。

芽孢杆菌合成的铁载体具有多样性。枯草芽孢杆菌B.subtilisCAS15能够合成铁载体catecholic siderophore 2,3-dihydroxybenzoate-glycine-threonine trimeric ester bacillibactin[22]。芽孢杆菌BacillusSp. SD12能够合成异羟肟酸类型的铁载体[23]。苏云金芽孢杆菌BacillusthuringiensisATCC 33679合成铁载体bacillibactin，炭疽芽孢杆菌BacillusanthracisSterne strains和蜡状芽孢杆菌BacilluscereusATCC 14579能够分泌2种儿茶酚铁载体、1种携带3,4-dihydroxybenzoyl基团的铁载体petrobactin和携带2,3-dihydroxybenzoyl的铁载体bacillibactin[26]。淀粉液化芽孢杆菌BacilluslicheniformisVK21合成一种儿茶酚胺类型铁载体(Catecholic Siderophore)，经过氨基酸分析与核磁共振分析，确定其结构为2,3-dihydroxybenzoyl-glycyl-threonine[27]。

色谱图显示：由上至下分别m/z=881(RT=10.93)在不同碰撞能量下的二级质谱图，由上至下碰撞能量依次为10、20、30、40V)图5 UPLC-ESI-MS/MS质谱图Fig.5 UPLC-ESI-MS/MS spectra

图6 铁载体对DPPH自由基的清除率Fig.6 Eliminating ratio of hydroxyl radical by siderophore

铁载体的发酵一般是在低铁培养基中完成。在培养基中加入一定浓度的锰离子，能够显著提高淀粉液化芽孢杆菌BacilluslicheniformisVK21分泌铁载体的水平[27]。巨大芽孢杆菌BacillusmegateriumATCC 19213合成铁载体于葡萄糖是否存在无关，甘油作为碳源能够显著提高铁载体的水平，甘露糖具有相反作用，静止培养铁载体水平显著低于震荡培养[28]。本研究中，适当浓度的甘油、精氨酸、铝离子和铜离子，能够促进铁载体的分泌。

4 结 论

本文对菌株B.subtilisMB8分泌的铁载体进行了研究，发现在铁胁迫条件下分泌的铁载体水平较高，分泌的铁载体具有良好的抑菌作用、清除DPPH自由基的抗氧化能力和加速不溶性针铁矿溶解的能力。此外，利用UPLC-ESI-MS/MS对B.subtilisMB8产生的铁载体进行分析，初步推断铁载体结构含有2,3-二羟基苯甲酸、甘氨酸和苏氨酸，与已知铁载体Bacillibactin具有相似结构。B.subtilis菌株MB8能够产生芽孢，对逆环境有一定的耐受能力，更易于保存和运输，在多种领域可能具有较好的应用前景。