苏咏梅，朱文进，周 晓，张同玉，李祥龙，吴建华

（河北科技师范学院动物科技学院，河北秦皇岛 066600）

毛色是家畜品种的主要特征，是识别家畜品种和个体的重要依据和主要标志，毛色做为家畜生物学性状其经济价值在不同家畜及其类型中差异很大[1]。中国家驴的毛色没有马的复杂，但也多种多样，且各地命名不一。中国家驴的毛色基本可分为单色毛和混合色毛两大类，其中单色毛主要有纯黑色和白色2 种，这类毛没有杂色，且终生不变；混合色毛主要有粉黑色、皂角黑色、灰色、青色、苍色、栗色、银河毛和花毛等，这类毛色由不同毛色混杂或毛色随年龄的增长深浅有变化[2]。

驴是传统的役用动物，对其毛色的选育和研究较少[3-11]。ASIP 基因是家畜毛色性状的主要候选基因之一。Abitbol 等[3]在对法国驴毛色的研究中发现，纯黑色驴 ASIP 基因编码区第3 外显子有1 处隐性错义突变（c.349 T＞C），使该位点编码的氨基酸发生变异（由半胱氨酸变为精氨酸），进而使黑色素合成累积，被毛呈黑色。驴ASIP 基因的错义突变（c.349 T＞C）可以形成CC 型、TC 型与TT 基因型，其中CC 基因型驴被毛为纯黑色，TC 与TT 基因型驴被毛为非纯黑色。为了解中国家驴毛色是否与ASIP 基因的该错义突变（c.349 T＞C）有关，本研究对中国家驴16 个品种 680 个体的ASIP 基因进行分析，为中国家驴毛色性状的研究提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 样品采集 实验用16 个驴品种血样采自河北、山西、山东、内蒙古、甘肃、陕西、新疆、宁夏、河南9个省的16 个地区，共计680 头驴的血样。驴的品种、数量、采样地及其毛色特征见表1。血样采自前腔静脉，ACD 抗凝，低温带回实验室，分装出3 mL 的一小份，4℃保存备用，其余置于-70℃冻存。

1.2 总基因组DNA 的提取与PCR 扩增 总DNA 的提取采用常规酚-氯仿抽提法[12]，特异性引物是参考文献[3]的序列，由北京赛百盛基因技术有限公司合成，引物的上游序列为5'-GGCCTCCATAGTCCAAAGAGC-3'；下游序列为5'-TTGCAGAAGGGACCTCAGGGT-3'。PCR 反应体系为25 μL：2×Es Taq Master Mix 12.5 μL，上下游混合引物1.5 μL（10 pmol/μL），DNA 模板2 μL（10 ng/μL），去 离 子 水9 μL，2×Es Taq Master Mix购自世纪康为公司（CWBIO）。PCR 反应条件：94℃预变性6 min；94℃变性40 s，58℃退火40 s，72℃延伸40 s，32 个循环；72℃修复延伸10 min。

PCR 产物用1.5%的琼脂糖凝胶电泳检测，将符合要求的PCR 产物进行下一步实验酶切或直接送北京诺赛基因组研究中心有限公司测序，PCR 产物胶纯化试剂盒购自天根生化科技（北京）有限公司。

1.3 PCR-RLFP 分析 酶切体系为20 μL：10×NE Buffer 2 μL，限制性内切酶Brs Ⅰ（10 U/μL，NEB 公司）0.4 μL，PCR产物10 μL，dd H2O 7.6 μL。65℃酶切20 min，80℃失活20 min，冷却后用2%的琼脂糖凝胶电泳（电压120 V 电泳1.5～2 h）。Bio-RAD 凝胶成像系统成像观察酶切效果，并记录分型。

1.4 统计分析 根据PCR-RLFP 分析结果，记录所有样品检测位点基因型，根据参考文献[13]计算公式，采用Excel 计算、统计基因型和基因频率。

2 结果与分析

2.1 中国家驴毛色特征 从表1 看出，中国家驴毛色以粉黑色、灰色和皂角黑色为主，另外还有少量纯黑色、青色和栗色，苍色、银河色和白色很少见，在采样过程中没有见到花色驴。大型驴和中型驴的毛色以粉黑色为主，小型驴的毛色以灰色为主；皂角黑为过度毛色，在大、中和小型驴中均有分布，每个驴品种的毛色有5 种以上，尽管有些毛色在一些品种中很少，这说明中国家驴选育程度较低。

2.2 中国家驴ASIP 基因的变异位点 选择有毛色性状记录个体的乌头黑驴6 头、粉黑驴6 头、皂角黑6 头灰色驴6 头、青色驴 6 头、栗色6 头、苍色5 头、银河4 头和白驴 2 头，共计47 头，对其ASIP 基因 PCR扩增产物测序（图1）表明，在中国家驴品种中存在ASIP 基因第3 外显子 c.349 T＞C 的突变。

图1 中国家驴ASIP 基因第3 外显子的突变位点

表1 实验用驴种、数量、采样地及毛色特征

2.3 中国家驴ASIP 基因的SNP 多态性 从图2 可以看出，ASIP 基因的PCR 产物在340 bp 位置与目的片段一致，而且条带清晰，特异性好；纯黑色驴的基因型以CC 为主，其酶切带型为340 bp 1 条带，表明不能被BsrⅠ内切酶切开；非纯黑色驴的基因型为TT型或TC 型，未检测到CC 基因型；TT 型纯合子酶切带型为209 bp 和131 bp 2 条，TC 型杂合子带型为340、209、131 bp 3 条，均表明能被Bsr Ⅰ内切酶切开。中国家驴ASIP 基因第3 外显子PCR-RFLP 表现出明显的多态性。

在纯黑色驴中，CC 基因型的检出率为89.29%（25/28），纯黑色德州驴、广灵驴、渤海驴和庆阳驴的基因型都是CC 型，检出率100%，而纯黑色晋南驴、阳原驴和新疆驴各有1 个纯黑色驴的个体不是CC 型。在非纯黑色驴（包括粉黑、皂角黑、灰色、青色、苍色、栗色、银河毛和白色）中，TT 或TC 基因型检出率为99.54%（677/680）。

图2 驴ASIP 基因的PCR 产物酶切多态性

2.4 中国家驴ASIP 基因的基因型频率与基因频率 从表2 可以看出，中国驴CC 型的频率很低（0.037），TT 型的频率最高（0.731），C 等位基因的频率很低（0.153），T 等位基因的频率很高（0.847）。

3 讨 论

关于家驴毛色调控的分子机制研究很少，主要集中在MC1R、ASIP、KTI 和STX17 等基因。Abitbol 等[3]选择法国登记注册的6 个品种127 头驴进行毛色对比试验，并将这127 头驴按照毛色分为两大类，即黑驴（9头）和三粉驴（118 头），发现黑驴的ASIP 基因上存在1 处隐性错义突变（c.349T＞C），导致编码区第117 位氨基酸由半胱氨酸突变为精氨酸，从而影响黑色素的形成过程，最终产生黑色被毛。Sun 等[8]和李诗颖[11]研究了中国13 个家驴品种590 个体ASIP 基因多态性与家驴毛色的关系，发现中国家驴ASIP 基因同样存在突变位点c.349T＞C，与Abitbol 等[3]研究结果一致，且突变位点c.349T＞C 可以将中国驴分为纯黑色驴（CC 型）和非黑色驴（TT 型或TC 型）。本研究同样证明，中国家驴ASIP 基因存在突变位点c.349T＞C，但与Abitbol 等[3]和Sun 等[8]研究不同的是在28 个纯黑色被检驴中有3个体不属于CC 基因型。非纯黑色驴中没有检测出CC基因型，只检测出TT 和TC 基因型，且TT 或TC 基因型的分布在不同品种和不同毛色中没有规律性，这与Sun 等[8]和李诗颖[11]的研究结果一致。

表2 中国16 个地方驴品种ASIP 基因的基因型频率与基因频率

在中国家驴品种中，纯黑色的个体较少，主要分布在德州驴及其周边驴种——渤海驴中。纯黑色驴在德州驴中占样本量的15.39%，渤海驴占14.82%。这与李诗颖[11]报道的德州驴纯黑色个体占样本量的比例为48.89%出入较大，这可能与采样对象或目的不同有关，本研究样品采自山东宁津的自然群体，而李诗颖[11]采自山东德州、东阿集团养殖场的驴群，可能经过有目的的选择或是为了专门研究纯黑色驴而采集纯黑色驴较多。Abitbol 等[3]发现，影响家驴毛色的ASIP 基因从三粉驴到黑色驴为隐性遗传，这解释了家驴中纯黑色个体少的原因。

纯黑色德州驴体型偏重，动作较迟钝，为中国驴种中的“重型驴”[14]；另外，德州驴皮是熬制阿胶的道地药材，特别是其中的纯黑色驴皮，被认为是极品阿胶的原料[15]，这也可能是德州驴中纯黑色驴多的原因。本研究中纯黑色驴个体基因型全部是CC 型。由此可见，利用ASIP 基因第3 外显子PCR-RFLP 标记对培育纯黑色的肉皮兼用的驴新品系或品种具有重要的指导意义。

4 结 论

中国家驴ASIP 基因第3 外显子存在c.349 T＞C 突变，PCR-RFLP 标记可以区分中国家驴纯黑色与非纯黑色，可以作为纯黑色家驴选育的分子标记。