胡昌弟　余旭良

[摘要] 目的 比較萋-尼抗酸染色（简称Z-N染色）冷染法与热染法查找抗酸杆菌的差异，探讨萋-尼抗酸染色冷染法的应用价值。 方法 选取2017年1～12月衢州市人民医院确诊为肺结核患者的痰标本355份，每份痰标本涂6张涂片。室温下干燥后于5 s内穿过酒精灯火焰上方4次固定。其中冷染法3张涂片滴加含有1% Triton X-100石碳酸复红染液，置室温5 min、15 min、30 min后分别用流水缓慢冲去染色液;再滴加5%盐酸酒精脱色1～3 min，用水缓慢冲洗;最后用碱性美兰复染1 min，用水缓慢冲洗;干燥后，用油镜观察。热染法3张涂片滴加不含1% Triton X-100石碳酸复红染液，然后加热到微微冒热气，分别放置5 min、15 min、30 min后用流水缓慢冲去染色液;其余步骤操作同冷染法。比较两种方法抗酸杆菌的阳性检出率、褪色速度等方面的差异。 结果 355份痰标本冷染法5 min、15 min、30 min阳性率分别为29.57%、32.68%、32.68%，平均阳性率为31.64%;355份痰标本热染法5 min、15 min、30 min阳性率分别为32.96%、32.68%和32.96%，平均阳性率为32.87%;经统计，差异无统计学意义（P>0.05）。两种方法的阳性片褪色速度结果比较，差异无统计学意义（P>0.05）。 结论 在萋-尼抗酸染色初染液石碳酸复红中加入表面活性剂Triton X-100，能改变分枝杆菌细胞壁的通透性，促进染料进入分枝杆菌的菌体。抗酸杆菌阳性检出率和阳性片的褪色速度与传统的热染法比较，差异均无统计学意义。与传统热染法比较，操作简单并避免了有害气体污染环境，是一种值得推广的方法。

[关键词] 萋-尼抗酸染色;抗酸杆菌;冷染法;热染法

[中图分类号] R446          [文献标识码] B          [文章编号] 1673-9701（2019）15-0110-04

Comparative analysis of the results of cold staining and heat staining of Ziehl-Neelsen acid-fast staining

HU Changdi   YU Xuliang

Department of Clinical Laboratory， Quzhou People's Hospital in Zhejiang Province， Quzhou   324000， China

[Abstract] Objective To compare the difference between Ziehl-Neelsen acid-fast staining cold staining and heat staining in finding acid-fast bacilli， and to explore the application value of cold staining method and heat staining method of Ziehl-Neelsen acid-fast staining. Methods A total of 355 specimens of sputum in diagnosed tuberculosis patients from January to December 2017 in Quzhou People's Hospital were selected. Six smears were applied to each sputum specimen. After drying at room temperature， it was fixed 4 times over the flame of the alcohol lamp within 5 s. Among them， 3 smears of cold staining method were added with 1% Triton X-100 stone carbonate red dyeing solution， and left at room temperature for 5 min， 15 min and 30 min， then slowly washed away the staining solution with running water. And then the smears were added with 5% hydrochloric acid alcohol to decolorize for 1-3 min and rinsed slowly with water. Finally the smears were counterstained with alkaline melanin for 1 min， and rinsed slowly with water. After drying， they were observed with oil mirror. The three smears of the heat-dyeing method were added with 1% Triton X-100 stone carbonate red dyeing solution， and then heated to slightly hot air， and the dyeing liquid was slowly washed away with running water for 5 min， 15 min and 30 min respectively. The remaining step operation was the same as the cold dyeing method. The difference in the positive detection rate and the fading speed of the acid-fast bacilli was compared between the two methods. Results The positive rates of 355 sputum samples of cold staining for 5 min， 15 min and 30 min were 29.57%， 32.68% and 32.68%， respectively. The average positive rate was 31.64%. The positive rates of 355 sputum specimens of thermal dyeing method for 5 min， 15 min and 30 min were 32.96%， 32.68%， and 32.96%， respectively， and the average positive rate was 32.87%. There was no statistically significant difference （P>0.05）. There was no significant difference in the fading speed of the positive films between the two methods（P>0.05）. Conclusion The addition of the surfactant Triton X-100 to the stone carbonate red initial dyeing solution of Ziehl-Neelsen stain can change the permeability of the mycobacterial cell wall and promote the entry of the dye into the mycobacteria. The positive detection rate of acid-fast bacilli and the fading rate of positive tablets are not significantly different from those of traditional heat-staining methods. And the method is simple to operate and avoids harmful gas pollution to the environment compared with the traditional thermal dyeing method. It is a method worth promoting.

[Key words] Ziehl-Neelsen acid-fast staining; Acid-fast bacilli; Cold staining method; Thermal dyeing method

目前，全球有大约1/3的人口感染结核分枝杆菌，有2000万活动性结核病患者，每年新发病例900万人，每年约有300万人死于结核病。中国是全球22个结核病高负担国家之一，我国结核病年发病人数约为 130万，占全球发病人数的14%，位居全球第2位[1]。一种好的检测、诊断方法对结核病的防控起到至关重要的作用。随着实验室诊断技术的发展，很多先进的技术被应用，Xpert MTB/RIF检测具有准确、快速、安全性高等优点[2-4]，但费用昂贵，患者较难承受。结核分枝杆菌液体培养虽然敏感度高，而且能进行菌种鉴定和药敏试验，但是操作相对比较繁琐，培养周期较长，平均报告阳性的时间需13 d[5]，阴性更是需42 d。因此痰涂片抗酸染色目前仍是各实验室重要检测结核分枝杆菌的方法。相对于其他检测方法，高质量的痰涂片镜检有自身特有的优势：（1）作为诊断手段，对传染性肺结核的诊断比X线的准确性高。（2）作为实验方法，技术相对简单，容易标准化和完成操作。（3）设备投入少，检查成本低。（4）从收到标本到报告结果的时间短，能够满足临床诊断的需要。（5）对涂阳患者的治疗效果，能够做出及时和准确的评价[6]。Z-N染色作为经典的涂片抗酸染色方法，目前仍被各个医院广泛使用。但是传统的热染法，在滴加石碳酸复红后需要加热，操作较为繁琐，而且石碳酸复红染液在加热时会产生挥发性苯酚气体，这种气体会污染环境，影响实验室工作人员的身体健康[7]。本文通过比较分析冷染法与热染法结果的差异，探讨萋-尼抗酸染色冷染法的应用价值。

1 材料与方法

1.1 标本来源

收集衢州市人民医院2017年1～12月确诊为结核患者痰标本355份，所有标本为患者漱口后咳出的深部痰液，放置于无菌痰盒内。

1.2 染液配置

1.2.1 石碳酸復红染液  称取碱性复红1 g 溶于10 mL 95% 乙醇中，然后加入5%石碳酸水溶液，直至100 mL。此染液用于热染法初染。

1.2.2 1%Triton X-100石碳酸复红染液  取1.2.1项石碳酸复红染液100 mL，加入Triton X-100 至终浓度为1%，此染液用于冷染法初染。

1.2.3 5%盐酸乙醇脱色液  取浓盐酸5 mL，缓慢加入95 mL 95%乙醇中。用于冷染法和热染法的脱色。

1.2.4 碱性美蓝复染液  取美蓝0.3 g，溶于50 mL 95% 乙醇中，加蒸馏水至 100 mL。使用时用蒸馏水进行5倍稀释。用于冷染法和热染法的复染。

1.3 主要材料

奥林巴斯 CX211显微镜、青岛海尔 HR40-ⅡB2 生物安全柜，帆船牌清洁﹑无油脂一端磨砂面的新玻片。

1.4 染色方法

1.4.1 涂片制备  取脱脂干燥的新玻片，用2B铅笔在磨砂一端写上患者姓名和编号，用折断的竹签茬端，挑取痰标本中呈脓样﹑干酪样可疑部分均匀涂抹成约10 mm×20 mm的卵圆形痰膜，每份痰标本涂片6张，尽量使每张痰片的取痰部位﹑痰膜厚度﹑痰膜大小基本一致;将涂好的痰涂片室温下干燥后于5 s内穿过酒精灯火焰上方4次将其固定。

1.4.2 染色方法  Z-N染色按《中国结核病防治规划痰涂片镜检标准化操作及质量保证手册》规定方法进行初染﹑脱色﹑复染[6]。其中热染法3张涂片滴1.2.1项石碳酸复红染液，染液要覆盖痰膜，然后加热到微微冒热气分别放置5 min、15 min、30 min后，用流水缓缓冲掉染液;再滴加5%盐酸酒精脱色1～3 min，用水缓慢冲洗;最后用碱性美兰复染1 min，用水缓慢冲洗;干燥后，用油镜观察。冷染法3张涂片滴加1.2.2项石碳酸复红染液后，染液要覆盖痰膜，放室温不加热，分别在5 min、15 min、30 min后，用流水缓缓冲掉染液;再滴加5%盐酸酒精脱色1～3 min，用水缓慢冲洗;最后用碱性美兰复染1 min，用水缓慢冲洗;干燥后，用油镜观察。

1.5 结果判断

显微镜镜检及结果判断严格按《中国结核病防治规划痰涂片镜检标准化操作及质量保证手册》[6]。抗酸杆菌阴性：连续观察300个不同视野，未发现抗酸杆菌;报告抗酸杆菌数：1～8条/300个视野;抗酸杆菌（+）为3～9条/100个视野，连续观察300个视野;抗酸杆菌（++）为1～9条/10个视野，连续观察100个视野;抗酸杆菌（+++）为1～9条/每个视野，连续观察50个视野。抗酸杆菌（++++）为≥10条/每个视野，连续观察50个视野。

1.6 统计学方法

采用SPSS 19.0进行数据分析，计数资料以[n（%）]表示，采用χ2检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 冷染法与热染法检测结果比较

冷染法5 min、15 min、30 min阳性率分别为29.57%、32.68%、32.68%;平均阳性率为31.64%;热染法5 min、15 min、30 min阳性率分别为32.96%、32.68%和32.96%，平均阳性率为32.87%。其中冷染法5 min的阳性率略低于同组别15 min和30 min的阳性率。冷染法5 min、15 min 和30 min比较，各阳性等级差异均无统计学意义（P>0.05）。热染法5 min、15 min、30 min的结果比较，各组各阳性等级差异均无统计学意义（P>0.05）。热染法与冷染法比较，各组之间均无明显差异（P>0.05）（表1）。

2.2 冷染法与热染法褪色速度比较

收集染色15 min所有阳性片（冷染法116张，热染法116张）进行褪色速度试验，每周重复阅读这些阳性片，当阳性变为阴性或出现量化误差即为褪色，统计结果表明冷染法与热染法阳性涂片褪色速度结果比较，差异无统计学意义（P>0.05）（表2）。

3 讨论

随着实验室诊断技术的发展，更多地检测技术被运用到痰标本检测中。Xpert MTB/RIF作为近年来发展起来的一种新的实时定量PCR检测技术，具有准确、快速、安全性高等优点，可同时对结核分枝杆菌以及利福平耐药进行快速检测，对于早期诊断发现传染源，控制结核病流行传播具有重要意义。但由于目前该检测项目尚未纳入医保，昂贵的检测费用以及检测需要相关的仪器，从而限制了其在基层医院的使用[8-9]。结核分枝杆菌液体培养是在培养管底部包埋荧光物质，可随着管内氧含量的变化而发生反应，若管中有分枝杆菌生长，则管内氧气被消耗，管底荧光物质被激活，在特定光源的激发下释放荧光，系统每小时监测培养管内的荧光强度1次，从而判斷管内分枝杆菌生长情况[10-11]。当痰中细菌达到100个/mL即能检出，但培养周期较长，平均报告阳性的时间需要13 d，阴性更是需42 d。因此，痰涂片镜检目前仍是各实验室重要检测结核分枝杆菌的方法。萋-尼氏抗酸染色镜检是目前国内主要的痰涂片镜检方式[12]。但是传统的热染法，在滴加石碳酸复红后需要加热，操作较为繁琐，且石碳酸复红染液在加热时会产生挥发性苯酚气体，这种气体会污染环境，影响实验室工作人员的身体健康。

结核分枝杆菌细胞壁中含有大量脂质而不易着色，由于结核杆菌细胞结构和细胞成分的这一特殊性，具有经碱性染料染色后能耐受酸性介质脱色的特性。萋尼染色的基本原理即根据结核杆菌这一特性先用石碳酸复红加温使抗酸杆菌着色，加温着色后的抗酸杆菌能够耐受酸性酒精脱色，显微镜观察时保持红色，而其他脱落细胞以及标本中的非抗酸菌被酸性酒精脱色后可被复染液美蓝染为蓝色[13]。

Triton X-100（聚乙二醇辛基苯基醚）是一种非离子型表面活性剂，能改变分枝杆菌细胞壁的通透性，促进染料进入分枝杆菌的菌体，在初染液中加入Triton X-100起到助染的作用，无需加热即能使抗酸杆菌着色[14]。着色后的抗酸杆菌同样能够耐受酸性酒精脱色，抗酸杆菌保持红色，而其他脱落细胞以及标本中的杂菌被酸性酒精脱色后可被复染液美蓝染为蓝色。此外Triton X-100还是一种很好的分散剂，能分散标本中成堆出现的分枝杆菌，更利于找到抗酸杆菌。

本研究表1显示，冷染法5 min、15 min、30 min阳性率分别为29.57%、32.68%、32.68%，平均阳性率为31.64%;结果与相关报道一致[15-17]。热染法5 min、15 min、30 min阳性率分别为32.96%、32.68%和32.96%，平均阳性率为32.87%，结果与相关报道一致[18-20]。冷染法5 min、15 min和30 min比较，各组各阳性等级差异均无统计学意义（P>0.05）。热染法与冷染法比较，各组之间均无明显差异（P>0.05）。

通过观察，热染法组随着染色的时间的延长阳性率未有明显的差异，显微镜下看到的抗酸杆菌红色明显，表明只要按照《中国结核病防治规划﹑痰涂片镜检标准化操作及质量保证手册》规定加热5 min即能满足要求。冷染组初染时间5 min的阳性率略低于其他组别，这可能由于少部分细菌细胞壁较厚，染料进入菌体较慢，但随着初染时间增加到15min，其染色的结果与所有的热染法比较，阳性率无明显差异，表明少部分未染上色的抗酸杆菌，通过延长染色时间还是能着色的。因此，我们建议用冷染法时，第一步初染的时间不能低于15 min。

本研究结果显示，冷染法与热染法阳性涂片褪色速度比较，差异无统计学意义（P>0.05），两者的分枝杆菌形态也无差异。因此，冷染法与热染法对阳性片的保存、实验人员的镜检以及盲法复检可完全等同操作。

目前实验室检测结核杆菌的方法很多，但传统的Z-N染色，仍然以其价廉、简单、快速以及能对患者的疗效评价等优点，为广大医院所使用。但是传统的热染法，在滴加石碳酸复红后需要加热，操作较为繁琐，而且石碳酸复红染液在加热时会产生挥发性苯酚气体，这种气体会污染环境，影响实验室工作人员的身体健康。冷染法是传统法的初染液石碳酸复红中加入表面活性剂Triton X-100，能改变分枝杆菌细胞壁的通透性，促进染料进入分枝杆菌的菌体，只要把第一步初染的时间延长到15 min，即能得到可靠的结果。

综上所述，冷染法对比传统的热染法，减少了加热等繁琐的步骤，减少了苯酚等有害气体对实验室环境以及人员的影响，是一种值得推广的方法。

[参考文献]

[1] 国务院办公厅.“十三五”全国结核病防治规划[EB/OL].（2017-02-01）[2017-04-15].http：//www.gov.cn/zhengce/content/2017-02/16/content_5168491.htm.

[2] 张玉华，张国钦，钟达，等. 应用Xpert MTB/RIF 法对我国肺结核诊断及利福平耐药检测的Meta分析[J]. 现代预防医学，2017，44（12）：2116-2119.

[3] Walters E，van der Zalm MM，Palmer M，et al. Xpert MTB/RIF on stool Is useful for the rapid diagnosis of tuberculosis in young children with severe pulmonary disease[J]. Pediatr Infect Dis J，2017，36（9）：837-843.