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基于ITS2序列的金莲花种子DNA条形码鉴定研究*

2019-07-09王金灿王春淼冯丽肖石林春刘金欣

承德医学院学报 2019年4期
关键词:金莲花条形码中药材

王金灿,王春淼,赵 晴,冯丽肖,石林春,刘金欣、△

(1.承德医学院中药研究所/河北省中药研究与开发重点实验室,河北承德 067000;2.中国医学科学院/北京协和医学院药用植物研究所)

金莲花为毛茛科植物金莲花Trollius chinensisBunge.的干燥花,味苦、微寒,主治上呼吸道感染[1]。在我国金莲花有16种,分布于河北、山西等地,其中以河北省承德坝上所产的金莲花药材最佳[2]。金莲花的药用价值较高,但其野生资源不足,难以满足市场需求,需要大规模人工种植。而种子是中药材种植的源头,因此保障金莲花种子的真伪就显得尤其重要。由于金莲花种子的形态学特征不明显,无法使用传统的方法来判断金莲花种子的真伪。DNA条形码分子鉴定技术是利用基因组中一段公认的、相对较短的DNA序列,来进行物种鉴定的一种分子生物学技术,这项技术几乎不受环境、被鉴定物形态等情况的影响,可以很好弥补传统鉴定方法的不足[3-5]。DNA条形码分子鉴定技术已经成功鉴定了桔梗[6]、黄芩[7]、知母[8]等中药材的种子,但对金莲花种子的鉴定尚未有研究。本研究以金莲花种子为研究对象,采用DNA条形码技术对金莲花种子的基原进行了鉴定,以期为鉴别金莲花种子的真伪提供依据。

1 仪器与材料

MM400型球磨仪(德国Retsch公司),1-14型离心机(德国Sigma公司),NanoDrop 2000c型超微量分光光度计(美国Thermo Fisher Scientific公司),天根植物DNA提取试剂盒(天根生化科技(北京)有限公司),PCR Master Mix试剂(北京艾德莱生物科技有限公司)。

来自金莲花道地产区河北省承德市和内蒙古自治区的金莲花种子9份,见表1:

表1 金莲花种子样品信息

2 方法与结果

2.1 DNA提取,PCR扩增和测序 从收集到的9份不同产地的金莲花种子样品中,每份样品选取3粒籽粒饱满的种子,分别进行编号(共27个实验编号)并使用天根植物DNA提取试剂盒提取单粒种子的DNA,提取操作步骤参照试剂盒说明书进行,使用超微量分光光度计鉴定金莲花种子DNA的质量。参照《中药材DNA条形码分子鉴定指导原则》扩增ITS2序列,PCR产物经纯化后,使用测序仪进行双向测序,并参照《中药材DNA条形码分子鉴定指导原则》判断测序峰图质量。

结果显示27个实验样品的DNA浓度平均值为26.2g/μl,DNA的A260/A280位于1.8~2.0之间,A260/A230的平均值约为1.18,说明所提取的DNA纯度较高。采用琼脂糖凝胶电泳法和凝胶成像法检测PCR扩增产物,所得电泳见图1,在480bp的位置上有明显条带。双向测序所得测序峰图分离程度高,无重叠峰出现,可进行序列拼接获取ITS2序列。

图1 琼脂糖凝胶成像电泳图谱

2.2 序列比对、NJ系统发育树构建和BLAST分析 利用Muscle 3.8软件进行多序列比对,用中药材DNA条形码鉴定系统(http://www.tcmbarcode.cn)进行BLAST鉴定分析,利用MEGA 7.0软件构建NJ系统发育树,使用BLAST法和NJ系统发育树法进行物种鉴定。

9份金莲花种子样品,每份样品选取3粒,共获得27条ITS2序列,相关序列已提交至NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov)。基于建立的金莲花ITS2条形码数据库,分别使用NJ系统发育树法和BLAST方法进行基原物种鉴定。由NJ系统发育树可知,所有样品分为两支,JLHZ03(Z31、Z32、Z33)和JLHZ04(Z41、Z42、Z43)单独聚为一支,与其它样品区分明确(图2);经BLAST比对后可鉴定出JLHZ03和JLHZ04为播娘蒿,其余序列可鉴定为金莲花。

图2 金莲花种子样品NJ系统发育树

3 讨论

本研究结果显示除JLHZ03和JLHZ04两份样品为播娘蒿外,其余7份金莲花种子均为正品。金莲花可清热解毒,主治上呼吸道感染、扁桃体炎等疾病,其中以治疗上呼吸道感染最为有效,具有较高的医用价值[1]。然而,金莲花在自然状态下根的再生能力差,仅靠种子繁殖,但其种子常随着药用部位—花的被采摘使用而遗失,因此造成了种质资源的流失[9],而金莲花的这种特点导致目前市场上金莲花种子的市售价格较高(平均900元/斤)。播娘蒿在除华南外全国各地均可生产,资源充足,因此其种子的市售价格远低于金莲花种子,且与金莲花种子外观形态相似,难以通过形态特征进行区分,部分商家为了追逐利益在金莲花种子中混入了播娘蒿种子。根据2015版《中国药典》[10]记载,播娘蒿以种子入药,药材名为葶苈子,葶苈子可以泻肺平喘、行水消肿,与金莲花的功效截然不同。在金莲花种子中混入播娘蒿种子不仅会给农户造成严重的经济损失,还会增加临床安全用药的风险。

然而,金莲花种子的形态学特征不明显,无明显的种脐等特征,传统的形态鉴定方法在鉴定金莲花种子上存在一定的局限性,因此亟需一种新的手段来鉴定金莲花种子。DNA条形码分子鉴定技术显著推动了分类学的发展[11-12],同时中药材DNA条形码分子鉴定法指导原则已经成功纳入2015年版《中国药典》[13],中药材DNA条形码分子鉴定技术也已经深入到中药材生产的源头-中药材种子的鉴定研究[6]。本研究以市售金莲花种子为研究对象,基于ITS2序列对其基原进行鉴定,结果显示ITS2序列可以用于鉴定金莲花种子。因此,本研究可为在源头上保证金莲花物种子的真伪提供依据。

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