张亚杰 李劭彤 李朝阳 罗湘南 田晶 李巧玲

摘要：从农药厂排放污泥中筛选分离得到1株可以以甲氰菊酯为唯一碳源生长的细菌菌株W-10，经鉴定为粪产碱杆菌。考察其对甲氰菊酯（FP）、氯菊酯（PM）和高效氟氯氰菊酯（β-CF）的降解特征，降解半衰期分别为5.06、3.40、4.03 d，重点研究菌株W-10对不同异构体和对映体的降解差异。结果表明，3种菊酯虽然结构相近，但氯菊酯和高效氟氯氰菊酯的顺反异构体呈现不同的降解选择性，菌株W-10分别优先降解氯菊酯的顺式体和高效氟氯氰菊酯的反式体;此外，菌株W-10对对映体的降解选择性则主要体现在高效氟氯氰菊酯反式异构体所包含的一对对映体上。

关键词：甲氰菊酯;氯菊酯;高效氟氯氰菊酯;微生物降解;异构体;对映体;选择性降解行为

中图分类号： X132;X592  文献标志码： A  文章编号：1002-1302（2019）10-0278-03

拟除虫菊酯是人工合成的一类仿生农药，广泛用作农业和卫生杀虫剂。菊酯农药种类较多，结构也较类似，大多数含有1个或者多个手性中心，立体结构较为复杂，一般包含2个以上顺反异构体，同时每个顺式或反式异构体又含有1对对映异构体。研究表明，不同的菊酯异构体，其杀虫活性及对非靶标生物的毒性往往存在很大差异[1-2]。同时当菊酯施用到田间后，不同异构体在环境中的消解也显示出很大的不同，这种差异主要是由环境微生物的代谢作用造成[3-4]。当前，国内外有关菊酯在环境中对对映体或异构体的选择性降解有很多研究[5-7]，但从微生物水平上考察单一微生物菌株对菊酯异构体的降解差异，则只有很少的报道[8-9]。本研究从农药厂污泥中筛选得到1株菊酯的优势降解菌株，研究其对甲氰菊酯（FP）、氯菊酯（PM）和高效氟氯氰菊酯（β-CF）（结构见图1）的降解行为，重点考察其对不同异构体和对映体的降解特征。相关研究结果有助于阐释菊酯农药在环境中的对映体选择性降解行为，同时可为菊酯农药的微生物强化修复提供理论和试验依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

污泥取自河北省石家庄某农药厂;甲氰菊酯乳油（89%）由河北威远生物化工股份有限公司惠赠;甲氰菊酯标准样品（98%）购自上海市农药研究所;正己烷、乙酸乙酯、异丙醇等购自天津市大茂化学试剂厂，均为色谱纯。本试验于2016年在河北科技大学生物科学与工程学院实验室完成。

1.2 培养基

富集培养基：蛋白胨10 g、NaCl 1 g、KH2PO4 1 g、水 1 000 mL（pH值为7.0～7.2）;普通培养基：牛肉膏3 g、蛋白胨10 g、NaCl 5 g、水1 000 mL（pH值为7.0～7.2）;基础培养基：NH4NO3 1.00 g、MgSO4·7H2O 0.50 g、（NH4）2SO4 0.50 g、KH2PO4 0.50 g、NaCl 0.50 g、K2HPO4 1.50 g、酵母浸粉0.05 g、水1 000 mL（pH值为7.0～7.2），固体培养基在此基础上加入2%琼脂粉。

1.3 试验仪器

安捷伦1200型高效液相色谱仪（带G1314B紫外检测器）、超净工作台、超声波清洗器、pH计、摇床、灭菌锅等。

1.4 菊酯降解菌的筛选

将100 mL含甲氰菊酯农药（100 mg/L）的富集培养基装入250 mL三角瓶中，灭菌、冷却后加入污泥10 g，于30 ℃、180 r/min下摇床培养7 d，此后按10%的接种量转接到下一批含甲氰菊酯（质量浓度依次为100、200、300、400、500 mg/L）的富集培養基中，每个浓度在相同条件下培养7 d后，再按10%的接种量转接到含甲氰菊酯为500 mg/L的基础培养基中，继续培养14 d，此后进行梯度稀释并涂布到普通固体培养基上，反复进行平板划线分离，直至得到单菌落，将单菌落进行甘油管保存，最终得到3株优势菌株。通过后续甲氰菊酯降解试验，选择降解性能最好的1株进行详细研究，命名为W-10。

1.5 菌种鉴定

将稀释好的菌液涂布于牛肉膏蛋白胨培养基上，待菌落长出后，采用革兰氏染色以及芽孢染色后镜检。另外进行葡萄糖发酵试验、甲基红试验等生理生化鉴定[10]，并提取菌株DNA扩增后送往生工生物工程（上海）股份有限公司进行测序，将16S rDNA的序列结果与GenBank数据库中的核酸数据进行同源性对比[11]。

1.6 降解效能的测定

以W-10菌株为种菌，进行菌液配制，以接菌量5%（菌液D600 nm≈0.5）接种到装有100 mL含10 mg/L甲氰菊酯的无菌液体基础培养基中，加入1 mL吐温-20，以含相同浓度无菌液体基础培养基作对照，在30 ℃、180 r/min下振荡培养，分别在0、2、4、6、8 d取样，使用液相色谱进行总量及手性测定。氯菊酯和高效氟氯氰菊酯的降解测定试验与甲氰菊酯相同。色谱条件为非手性高效液相色谱（HPLC）的色谱柱为正相硅胶柱（购自大连伊利特分析仪器有限公司，250 mm×4.6 mm），流动相为正己烷 ∶ 异丙醇=100 ∶ 0.08（体积比）;手性HPLC色谱柱、甲氰菊酯和高效氟氯氰菊酯为Chiralcel OD-H（购自日本大赛璐化学工业株式会社，250 mm×4.6 mm），氯菊酯为Chiralcel OJ-H（购自日本大赛璐化学工业株式会社，250 mm×4.6 mm），流动相均为正己烷 ∶ 异丙醇=100 ∶ 2（体积比）。非手性和手性HPLC的检测波长均为230 nm，流速为1.0 mL/min，进样量为20 μL。具体色谱分析方法参见文献[12]。

2 结果与分析

2.1 菌株鉴定

菌株W-10是能以甲氰菊酯为唯一碳源生长的细菌，该菌属革兰氏染色阴性短杆菌，葡萄糖发酵试验为阴性，甲基红试验为阴性，常成单、双或成链状排列，无芽胞，专性需氧。W-10菌株测定的16S rDNA序列长度为1 499 bp，与粪产碱杆菌（Alcaligenes faecalis）AU02的同源相似性达99%，初步鉴定为产碱菌属中的粪产碱杆菌。

2.2 菊酯降解菌降解条件的优化

分别调节温度为10、20、30、40 ℃，pH值为5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0，接菌量为0.5%、1.0%、3.0%、5.0%、7.0%、10.0%，于180 r/min下振荡培养，培养6 d后取样测定降解率，进行条件优化试验。结果表明，该菌的最适生长条件为温度30 ℃、pH值7.0、接菌量5.0%，后续的菊酯降解试验均在该条件下进行。

2.3 菊酯顺反异构体的降解选择性

菌株W-10对3种菊酯的降解结果见表1。3种菊酯的降解符合一级动力学方程，按异构体总量计，甲氰菊酯、氯菊酯和高效氟氯氰菊酯的降解半衰期分别为5.06、3.40、4.03 d，降解快慢顺序为氯菊酯>高效氟氯氰菊酯>甲氰菊酯。

甲氰菊酯、氯菊酯和高效氟氯氰菊酯分别含有1、2、3个手性中心，因此甲氰菊酯含有2个对映异构体，无顺反异构体。氯菊酯和高效氟氯氰菊酯均含有1个顺式异构体和1个反式异构体，顺式异构体和反式异构体又分别含2个对映异构体，因此共有4个对映体。表1中也列出了氯菊酯和高效氟氯氰菊酯顺反异构体的降解数据，氯菊酯和高效氟氯氰菊酯存在明显的顺反异构体选择性。氯菊酯的顺式体降解明显快于反式体，顺反异构体半衰期分别为2.68、4.36 d，同时用立体异构体比率（stereoisomer ratio，简称SR）表示顺式体和反式体的浓度比值，降解过程中氯菊酯的SR值逐渐减小，从 0 d 的1.19减小到8 d的0.54。高效氟氯氰菊酯顺式体降解明显慢于反式体，半衰期分别为4.48、3.59 d，降解过程中其SR值从0 d的1.20逐步增大到8 d的1.57。图2给出了氯菊酯和高效氟氯氰菊酯降解0、8 d时的分离色谱图，可以清楚地看出cis-PM和trans-β-CF分别是2种菊酯降解较快的异构体。因此，W-10菌株对氯菊酯和高效氟氯氰菊酯的顺反异构体有着不同的降解选择性。

高效氟氯氰菊酯与氯菊酯在结构上只有很小的差异（图1），前者仅比后者多1个氰基和氟原子，因此结构上的微小差异可能会对化合物的异构体选择性带来较大影响，具体的微生物降解机制仍有待深入研究。同时，菊酯在土壤试验中，一般均为反式异构体快于顺式异构体[7，13]，而本研究中 W-10 菌株对氯菊酯顺式体降解快于反式体，与土壤试验相反，高效氟氯氰菊酯顺反式体的降解选择性则与土壤试验一致，这可能是由于土壤中的降解微生物有很多种，而本研究中仅为其中一种菌株的降解，土壤中不同的微生物菌群应该有不同的降解特征，农药降解为各種微生物的综合代谢作用。

2.4 菊酯对映异构体的降解选择性

菊酯所包含的对映异构体结构十分相近，只能在手性色谱柱上得到拆分，笔者所在课题组先期工作已研究了菊酯的手性拆分，并确定了各对映体的流出顺序[14]。本研究在手性柱上测试W-10菌株对各菊酯对映体的降解情况，并定义对映体比率（enantiomer ratio，简称ER）为先流出对映体与后流出对映体的浓度比值，具体结果见表2。甲氰菊酯和氯菊酯的ER值始终为1.00左右，说明对映体降解速率基本一致，没有选择性。高效氟氯氰菊酯顺式异构体所含的1对对映体也没有降解选择性，而反式异构体则显示出一定的对映体选择性 其ER值从0 d的0.99逐渐增大 到8 d时为1.13，说明色谱柱上先流出的1R-trans-β-CF降解略慢于后流出的1S-trans-β-CF，具体的手性分离色谱图见图3，2种对映体的半衰期分别为3.77、3.43 d。

3 结论与讨论

本研究表明，微生物菌株对菊酯的降解选择性与菊酯的结构密切相关，化合物结构的微小差异可能造成异构体选择性的根本不同，因此研究微生物对手性污染物的降解和修复时，必须将不同异构体分别进行考察，其原因可能与微生物体内降解酶的特定手性结构有关，具体的作用机制仍有待深入研究。同时，微生物的手性降解可以更加有针对性地降解手性污染物的特征异构体，因此采用适宜的微生物菌株，有利于提高环境污染中手性农药的降解修复效果。

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