陈丽潇 王跃华 刘鑫 惠麦侠 赵利民 赵小平

摘要：以10个抗根肿病大白菜品种为试材，研究影响小孢子出胚的因素，并对DH植株进行根肿抗性分子检测。结果表明，基因型是影响出胚的最主要因素，参试的10个品种中仅有3个出胚，其中15CR82出胚率最高，为 3.36个/蕾。基因型还决定了胚状体的类型及大小，胚的大小对于转绿成苗率有一定影响。一般直径大于2 mm的胚状体容易转绿成苗。用根肿抗性基因CRa的特异分子标记CRaEXON4-3筛选DH群体，获得27个携带抗性基因植株。

关键词：大白菜;抗根肿病;游离小孢子培养

中图分类号： S634.103  文献标志码： A  文章编号：1002-1302（2019）10-0141-03

大白菜（Brassica campestris ssp. pekinensis）属于十字花科芸薹属芸薹种大白菜亚种，是一种起源于我国的重要蔬菜作物。根肿病是由芸薹根肿菌（Plasmodiophora brassicae Woron）侵染引起的一种世界性病害[1-2]，主要感病植物有大白菜、青菜、芥菜等十字花科蔬菜[3]。根肿病病菌被归为原生界根肿菌门，其通过侵染十字花科植物根毛导致根部薄壁细胞增生而形成肿瘤[4]，从而影响植物吸水功能[5]，使地上部分生长迟缓、缺水萎蔫[6]。该病最初于1737年被发现在地中海西岸（英国）和欧洲南部（前苏联列宁格勒），由于该病传染力强，传播途径多，感病植物根部释放的休眠孢子在土壤中存活可达10年[7]，随后在世界各地的十字花科蔬菜种植区域蔓延扩散。又由于发病初期蔬菜地上部分的症状不明显，不易被发现，使得发病地区减产严重，根肿病又有“根癌”之称，已成为一种世界性难题。

近年来，根肿病的防治方法主要有农业防治、生物防治、化学防治及抗病育种等。而从环境保护、成本、管理难易程度等方面考虑，选用抗病品种是目前防治根肿病的最佳方案[8]。游离小孢子培养（isolated microspore culture，简称IMC）技术是由Nitsch在进行花药培养的同时创建和发展的，1982年德国的Lichter率先在甘蓝型油菜上成功地进行了游离小孢子培养，并发现小孢子胚胎及其再生植株的产量远高于花药培养[9]，这引起了育种工作者的浓厚兴趣，此后小孢子培养技术在农作物，尤其是芸薹属蔬菜作物中得到了迅速发展。利用游离小孢子培养技术，可以快速纯化含有抗病基因的植株，并从大量的抗病双单倍体（doubled haploid，简称DH）群体中，寻找具有优良生物性状的植株作为亲本进行下一步的育种工作。本研究以10份市售的抗根肿病大白菜品种为材料，筛选易出胚的基因型材料，并利用根肿抗性基因CRa分子标记对种质进行筛选，以期为大白菜抗根肿病新品种的选育奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试抗根肿病大白菜材料为15CR37、15CR38、15CR53、15CR82、15CR104、15CR121、15CR122、15CR128、15CR132、15CR136，均由西北农林科技大学十字花科蔬菜研究室提供。

1.2 试验方法

1.2.1 試材准备 材料于2016年10月15日播种于陕西省油菜杂交中心大田，自然条件下春化，常规田间管理，于2017年3月26日始花期至4月22日终花期取材培养。

1.2.2 游离小孢子培养 在大白菜初花期和盛花期，于每天08：00—11：30摘取健壮花序上未开的花蕾，花蕾长度为 2.0～3.5 mm。用镊子挑开花蕾，小心挤出花粉，利用显微镜挑选细胞为圆球形，小孢子发育处于单核靠边期，且细胞有一定透光度的花蕾。如细胞为三角形及其他不规则形状，并且细胞颜色极浅则是时期过早，花蕾过小;如细胞成椭圆形且中部较暗透光较差，则是花粉已成熟，花蕾过大。挑选好的花蕾先用75%乙醇消毒1 min，再用0.1%氯化汞消毒15 min，无菌水冲洗3遍。加入6～10 mL的B5洗涤培养基（含13%蔗糖），用玻璃棒碾压花蕾使花蕾破碎，小孢子游离于B5培养基中，用50 μm孔径的尼龙网过滤，收集滤液于离心管中。1 200 r/min 离心5 min，弃去上清液后加入B5培养基悬浮花粉，再次离心，重复3次后弃去上清液，加入含有100 mg/L秋水仙碱的NLN-13液体培养基（含13%蔗糖）悬浮小孢子。将小孢子悬浮液稀释后分装于4个60 mm的培养皿中，每个皿的培养基体积约为5 mL，用封口膜封口，放于32 ℃培养箱中，暗培养48 h。取出未污染的样品，将悬浮液加入离心管中，1 200 r/min离心5 min，弃去上清，加入10 mL NLN-10液体培养基（含10%蔗糖）悬浮花粉，将悬浮液加入到90 mm培养皿中，封口后放入25 ℃条件下进行暗培养。经过10～15 d出现肉眼可见的白色细小颗粒，将出现白色细小颗粒的培养皿放到室温下的摇床上避光振荡培养，15 d后统计出胚率及胚胎类型。胚状体的直径小于1 mm时，不统计在内。

1.2.3 基因型对小孢子胚胎发生的影响 10份大白菜材料进行游离小孢子培养，暗培养10 d、振荡培养15 d后统计出胚率及胚胎类型。每个品种各挑取100个花蕾分装于4个培养皿中，每个培养皿25个花蕾。

1.2.4 胚状体种类对转绿成苗的影响 所有胚状体均统一转入MS固体培养基（MS+0.2 mg/L KT+30 g/L蔗糖+8 g/L琼脂），放到光—暗周期为12 h—12 h，光照度为 1 500 lx，温度为24 ℃的培养间，2周后分别统计其转绿率。

1.2.5 DH群体分子筛选 所有获得的小孢子植株，剪取少量叶片组织，用简化CTAB法提取DNA，用笔者所在课题组开发的根肿病抗性基因CRa特异分子标记进行筛选，统计条带类型。

2 结果与分析

2.1 基因型对大白菜游离小孢子出胚率的影响

不同基因型的抗根肿病大白菜小孢子的胚胎发生能力差异很大。由表1可知，10个供试材料有3个得到了胚状体，成功率为30%。其中15CR82出胚率最高，为3.36个/蕾，其次为15CR136，出胚率为1.32个/蕾，15CR53的出胚率最低，为0.84个/蕾。

2.2 基因型对大白菜游离小孢子胚状体类型的影响

胚状体的形状和大小与基因型也存在很密切的关联。材料15CR82的胚状体主要为子叶型胚与球形胚，且数量多体积小，直径一般为0.5～3.0 mm，直径小于1 mm的胚数量较多。材料15CR53和15CR136的胚状体则主要为子叶型胚与畸形胚，且体积较大，直径一般为1～8 mm（图1）。

2.3 胚状体类型对大白菜胚状体转绿的影响

由表2可知，当胚状体的体积达到一定大小时，有助于其转绿。子叶胚相对于其他类型胚状体更容易成苗，子叶胚宽度小于2 mm时 一般很难转绿 也就无法成苗。15CR53和15CR136的子叶胚较大，容易转绿，其转绿率分别为67.3%、69.7%，15CR82的胚状体数量最多，体积小，大部分直接白化、褐化，转绿的胚状体数量较少，转绿率极低，只有19.8%。

2.4 DH群体分子鉴定

由图2可知，对获得的40个DH植株进行CRa基因的分子检测，植株间表现多态性，扩增条带大小为705 bp的有27株，含抗性基因CRa，表现为纯合抗病，扩增条带大小为 413 bp 的有9株，不含抗性基因CRa，表现为感病。由结果可知，纯合抗病植株与感病植株比为3 ∶ 1。4、27、28、29号样品条带大小为500 bp，与其他材料的大小不一致，表现为材料间多态性。

3 结论与讨论

基因型对游离小孢子培养的胚状体发生来说是最关键的因素之一，Bhatia等利用30个印度花椰菜品种进行研究，其中13个品种得到了胚状体[10]。卢松等用3个微型结球白菜品种进行试验，有1个品种得到了胚状体[11]。本试验以10个抗根肿病大白菜品种进行游离小孢子培养，其中有3个品种得到了胚状体。15CR82的出胚率最高（3.36个/蕾），而材料15CR53的出胚率相对较低（0.84个/蕾）。胚状体的发生不仅受到基因型的影响，而且还受一些外部条件的影响，同一品种胚状体的发生具有很大的偶然性，可能某一天出胚率极

高，也可能没有发生胚状体。在这个未知条件还没有解决之前，由于花期时长有限，试验中尽量保证每天有足够的花蕾是获得较多DH植株的一个简单直接的方式。

除了基因型对小孢子培养的影响外，如何高效利用已经形成的胚状体是一个亟待解决的问题。本试验发现，胚状体的大小对于转绿率的影响比较大，子叶胚宽度小于2 mm时，一般很难转绿，推测由于出胚率较高的品种、有限的空间及培养基限制了胚状体生长空间及获得较多营养物质。笔者尝试将较大的胚状体转出后，换成新的NLN-10培养基继续避光振荡培养，结果显示该方法可促进胚状体的生长，提高转绿率。归因于增加胚状体生存空间及可用营养物质，同时置换掉培养基中胚状体产生的一些有害代谢产物。同一品种在不同时期的出胚率也不一样，说明外在环境条件对胚状体发生也会产生一定影响，探究利于出胚的环境条件，也是一个可以有效提高易出胚品种出胚数的方法。

利用抗根肿病基因特异分子标记可以快速检测大白菜材料含有的抗病基因，本研究利用CRa特异分子标记检测获得的40个DH植株，有27个携带抗性基因CRa，纯合抗病植株与感病植株比为3 ∶ 1。所用供试母株材料为杂合植株，根据孟德尔遗传定律中的分离定律，预测试验结果纯合抗病植株与纯合感病植株比为1 ∶ 1，与本次试验结果相差较大。由于成苗过程中胚状体有大量损耗，所以无法判断是含有抗根肿病Cra基因的花粉更容易形成胚状体，还是含有抗病基因的胚状体更容易成苗。在后续试验中，可以通过拓宽供试材料基因型，增加出胚率、提高成苗率等有效方法来获取更多抗根肿病纯合种质资源，进而应用于抗根肿病育种实践当中。

参考文献：

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[10]Bhatia R，Dey S，Sood S，et al. Efficient microspore embryogenesis in cauliflower （Brassica oleracea var. botrytis L.） for development of plants with different ploidy level and their use in breeding programme[J]. Scientia Horticulturae，2017，216：83-92.

[11]卢 松，陶 莲，吴康云，等. 微型结球白菜小孢子的培养及植株再生[J]. 贵州农业科学，2015，43（8）：30-33.