杨郑州 黄柳芳 谢晓娜 苏仕林

摘要：为明确叶疫病病菌侵染芒果后细胞壁降解酶活性的变化，以台农芒果叶作为试验材料，通过体外培养的方法分离得到芒果叶疫病菌，将其接种于离体的芒果幼叶，利用3，5-二硝基水杨酸（DNS）法和紫外分光光度计法检测病原菌侵染过程中细胞壁降解酶活性的变化。结果表明，在细胞壁降解酶中，β-葡萄糖苷酶活性最高，羧甲基纤维素酶（Cx）活性与多聚半乳糖醛酸酶（PG）活性次之，聚甲基半乳糖醛酸酶（PMG）活性最低;纤维素酶在病原菌侵染初期最早分泌并起作用，并且纤维素酶比果胶酶对芒果叶片的致病作用明显。

关键词：芒果;叶疫病;细胞壁降解酶;活性测定;3，5-二硝基水杨酸法;紫外分光光度计法;减少产量损失

中图分类号： S436.67+9  文献标志码： A  文章编号：1002-1302（2019）10-0138-03

芒果被称为热带水果之王。在我国，芒果主要种植在东南部的云南和南部的贵州与广西地区[1-2]，芒果叶疫病别称为交链孢霉叶枯病，主要危害树冠下老叶，在一些实生苗与嫩叶上发病率高，其生长温度条件充足，在雨水充足时期发病率高，随着雨水的降临，叶疫病的菌丝可侵染嫩叶及抵抗力弱的老叶，具有一定的传染性。严重时可导致叶片大量枯死，影响植株生长。植物细胞壁是植物健康的保障，病原菌通过入侵植物细胞壁，分泌细胞壁降解酶使植物受到侵染，从而导致病害的发生。细胞壁降解酶是病原菌侵染寄主组织的主要致病因子之一[3]，本试验致力于研究植物细胞壁降解酶的种类与其在致病过程中所起到的作用，为进一步研究芒果与叶疫病菌的互作机制及减少芒果果产量损失提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

试验所用材料为台农芒果，摘取病叶为广西壮族自治区百色市右江区本地台农芒果树上的老叶，分离纯化得到芒果叶疫病病菌，针刺法接种于离体台农芒果幼叶，台农幼苗于2016年9月至2017年1月种植于百色学院实验楼前，待叶长至8张时，取不同植株同一位置的幼叶，以针刺后不接種菌丝的叶片为空白对照，放于28 ℃条件下倒置培养，分别于接种后2、4、6、8、10、12 d取样，而后样品保存于-20 ℃冰箱。

1.2 方法

1.2.1 病原菌的分离与纯化 摘取疑似芒果叶疫病的台农芒果叶片，于实验室用流水洗净，表面消毒后，使用0.1%氯化汞消毒1.5 min，75%乙醇消毒30 s，蒸馏水润洗3次每次 1 min;所用器皿均已高压灭菌，利用剪刀裁取病健交界处 0.5 mm2 左右叶片，放入马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）培养基中，28 ℃倒置培养。通过点接的方法分离纯化致病菌。

1.2.2 病原菌反侵染 根据柯赫氏法则将已纯化的菌丝分别接种至同一品种、同一长势的百色市本地健康无病害的实生苗上。摘取与叶疫病原症状一致的叶片，重新进行叶片中致病菌的分离，观察2种病菌是否为同一种。

1.2.3 酶液的提取 称取叶片1 g，放入研钵中，进行冰浴研磨，1 g样品中加入5 mL 1 mol/L NaCl提取液（20 mmol/L Tris-HCl缓冲液，pH值7.4），然后倒入10 mL离心管中，4 ℃，10 000 r/min离心15 min，上清液即为酶的粗提液，于 4 ℃ 保存。

1.2.4 羧甲基纤维素酶（Cx）活性测定 量取1 mL粗酶液，加入1 mL柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液，再加入1 mL底物（底物配制：称取0.1 g羧甲基纤维素钠溶于10 mL pH值为5.0的 50 mmol/L 柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液中），在50 ℃下酶解 30 min，加入1 mL 3，5-二硝基水杨酸（DNS），沸水浴 10 min，取出后经流水冷却，在540 nm处测定吸光度。

1.2.5 β-葡萄糖苷酶活性测定 参照“1.2.4”步骤，底物配制：称取0.1 g水杨苷溶于10 mL pH值为5.0的 50 mmol/L 柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液。

1.2.6 多聚半乳糖醛酸酶（PG）活性测定 参照“1.2.4”步骤，底物配制：称取0.1 g多聚半乳糖醛酸溶于10 mL pH值为5.0的50 mmol/L柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液。

1.2.7 聚甲基半乳糖醛酸酶（PMG）活性测定 参照“124”步骤，底物配制：称取0.1 g果胶溶于10 mL pH值为50的 50 mmol/L 柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液。

Cx、β-葡萄糖苷酶、PG与PMG的酶活性单位为50 ℃下1 min催化1 μg还原糖所需酶量，根据D-半乳糖标准曲线计算生成的还原糖，还原糖采用DNS比色法测定。

酶蛋白浓度测定按照Bradford的方法[4]进行，用考马斯亮蓝G-250显色，在595 nm处比色测定，用小牛血清蛋白（BSA）作标准曲线y=0.362 2x+0.078 1，r2=0.998 4。

2 结果与分析

2.1 芒果叶疫病病原菌形态结构

由图1、图2可知，此次分离得到的病原菌即为芒果叶疫病病原菌细极链格[Alternariatenuissima（Fr.）Wiltsh]，属半知菌类真菌。湿度大时病斑上出现灰色霉状物，即病菌分生孢子梗和分生孢子。梗单生或2～3根丛生，褐色，偶尔出现1个膝状曲折，分生孢子倒棍棒形，单生或2～4个串生，孢身褐色，大小为（18.8～31.3） μm×（8.0～12.5） μm，具横隔膜3～6个，纵隔膜1～3个，喙变化较大，色略浅，长3.8～11.3 μm。

芒果叶疫病病原菌前期生长较为缓慢，在生长至第3天后生长态势急剧上升，第7天可达到生长顶峰，第8天开始有孢子产生。病原菌菌丝生长形态细密、绵软，菌丝向上生长约0.5 cm，形成内凹外凸的形状，菌丝以散射状形势向外扩散，孢子以接种中心为圆心向培养基边缘部分扩散，在孢子生成过程中孢子可在培养皿中形成同心圆。

2.2 Cx活性测定

由图3可知，试验处理组酶活性在接种后4 d达到高峰，此时是对照组的1.365倍，随后酶活性开始下降，在12 d又达到第3次酶活性高峰，为对照组的3.938倍。对照组酶活性在培养过程中随着时间的推移整体逐渐降低。

2.3 β-葡萄糖苷酶活性变化

由图4可知，β-葡萄糖苷酶在接种后2 d达到酶活性高峰，是对照组酶活性的1.243倍，试验处理组在接种后10 d达到第2次酶活性高峰，是对照组酶活性的2.807倍。试验组β-葡萄糖苷酶活性在10 d后开始急剧下降，对照组 β- 葡萄糖苷酶活性随着时间的增加而下降。

2.4 PG活性的变化

由图5可知，接种后2 d试验处理组PG活性低于对照组PG活性，此时试验组叶片中PG活性受到抑制，接种后6 d PG活性逐渐上升，接种后8 d PG活性达到峰值，是对照组的2.596倍。对照组PG活性随着接种时间的增加整体逐渐减小。

2.5 PMG活性变化

由图6可知，试验处理组PMG活性在接种后4～6 d内无明显变化，接种8 d后受到明显抑制，接种10 d后活性达到高峰，是对照组PMG活性的1.568倍，对照组PMG接种后先急剧下降后达到平衡。

2.6 酶活醒比较

由图7可知，芒果感染叶疫病病菌后β-葡萄糖苷酶活性最高，Cx、PG活性次之，PMG活性最低。

3 结论与讨论

本试验探讨了细胞壁降解酶的致病性作用，试验从芒果叶疫病病原菌的提取到病原菌的致病机制研究，期间做了多次预试验与试验分析，并从中挑选出最佳的试验方案。本研究所用的芒果病叶最佳的消毒方法为流水冲洗5 min，氯化汞消毒溶液消毒1.5 min，75%乙醇消毒30 s，最后得出的芒果病叶细菌感染率最低。芒果叶疫病具有感染性，可通过空气中的水与风传播，孢子可随风依附在树叶上，遇水后生长，因此芒果叶疫病在雨季多发。病原菌侵染过程中相关酶的活性出现高低起伏变化可能是活体外叶片的自身免疫作用，β-葡萄糖苷酶在接种后2 d出現酶活性高峰，Cx和PG在接种后 8 d 出现酶活性高峰，这与前人研究结果一致。李敏等在研究可可球二孢产细胞壁降解酶在侵染芒果果实过程中的作用时发现可可球二孢在离体培养条件下或接种芒果果实后均可产生PG、PMG、多聚半乳糖醛酸反式消除酶（PGTE）、果胶甲基反式消除酶（PMTE）及Cx，其中PG、PMG和Cx活性较高，PGTE和PMTE活性极低[5]。在大量分泌的3种细胞壁降解酶中，PG和Cx活性高峰出现较早，PMG活性高峰出现较迟。芒果叶疫病病原菌侵染过程中，β-葡萄糖苷酶活性最高，Cx、PG活性次之，PMG活性最低。王麒然等研究花生品种对叶腐病的抗性鉴定时发现，花生叶腐病菌能产生果胶酶、纤维素酶、木聚糖酶、漆酶等细胞壁降解酶，无论活体外养还是接种植株体内都表现为果胶酶活性最高，其次是漆酶和木聚糖酶，活性最弱的是纤维素酶[6]。高增贵等研究发现，玉米茎腐病菌在活体内和活体外都能分泌细胞壁降解酶，其产生的果胶酶、纤维素酶等都对玉米胚根有明显的浸解作用，并且随着酶液浓度的升高浸解能力也逐渐增强，表明果胶酶、纤维素酶等细胞壁降解酶是玉米茎腐病菌的重要致病因子[7]。Lalaoui等研究发现，木聚糖酶在菜豆褐斑病菌（Phyllosticta phaseolina）致病中起重要作用[8]。陈晓林等研究发现，腐烂病菌在寄主体内产生细胞壁降解酶的活性变化规律不同，PMG和木聚糖酶在接种后最先被检测到活性显著升高，PMG活性于接种后第13天达到高峰，随后活性降低，而木聚糖酶和其他3种酶活性则随接种天数的增加活性不断增强;5种细胞壁降解酶中，Cx最大酶活性最低，而木聚糖酶活性最高，是其他酶最大酶活性的1.74～7.44倍[9]。因此，细胞壁降解酶是一些植物病原菌的重要致病因子。Kang等研究发现，引起小麦根腐的禾谷镰孢菌（Fusarium graminearum）分泌果胶酶活性高的菌株致病性相对强，并且果胶甲基半乳糖醛酸酶（PME）和PG不仅比其他酶活性高，而且它们之间还存在协同作用，突显果胶酶是该病菌的主要致病因子[10-11]。张大智等探讨了芒果细菌性角斑病在发病过程中产生细胞壁降解酶的种类及其在致病过程中的作用，结果发现细胞壁降解酶在病原菌的入侵和致病过程中起重要作用[12]。果胶酶在病原菌侵染初期最早分泌并起作用，纤维素酶主要降解次生壁，致病作用发生在后期，并且果胶酶比纤维素酶对芒果叶片的致病作用明显[12]。但本研究发现起主要致病作用的是纤维素酶，纤维素酶活性先达到峰值，之后果胶酶活性才升高，这可能是因为致病菌的不同而导致了二者分泌先后顺序的差异。本研究通过对芒果活体接种叶疫病病菌产生的细胞壁降解酶进行活性分析，也表明β-葡萄糖苷酶活性最高，Cx、PG、PMG活性与病菌侵染芒果及叶疫病发生密切相关，进一步明确了细胞壁降解酶在一些病菌致病中起着重要作用，是主要的致病因子的观点。

本研究表明，病原菌侵染宿主时，起主要作用的细胞壁降解酶是β-葡萄糖苷酶，羧甲基纤维素酶二者都属于纤维素酶，纤维素酶起作用不断分解植物的细胞壁，降低机体免疫力;而在接种之后，PG与PMG开始活跃，二者都属于果胶酶，致病菌开始生长;也即是纤维素酶在病原菌侵染初期最早分泌并起作用，并且纤维素酶比果胶酶对芒果叶片的致病作用明显。

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