彭玉萌 霍光华 谭明辉 陈绪涛 肖大瑾

摘要：探索无患子抗稻瘟病病菌的活性成分，运用大孔吸附树脂及硅胶柱层析对无患子皂苷进行分离纯化，采用薄层色谱法和高效液相色谱法定性、光度比色法定量、核磁共振和质谱法确定结构、琼脂稀释法评价抗稻瘟病病菌活性。结果显示，无患子提取物过D101大孔吸附树脂的70%乙醇洗脱液，再经过硅胶柱，收集到由三氯甲烷-甲醇（体积比分别为1 ∶ 1、3 ∶ 1、5 ∶ 1、7 ∶ 1、9 ∶ 1）洗脱下来的5个活性组分，该5个组分的抗稻瘟病病菌EC50分别为46.84、5119、23.13、29.92、40.85 μg/mL。进一步纯化7 ∶ 1、5 ∶ 1流分，分别获得1个单体成分和含有2种成分的混合物，在浓度为20 μg/mL时，抗菌率分别为84.16%、81.24%。该单体结构经波谱分析和文献比对被鉴定为常春藤3-O-α-D-木吡喃糖基（1→3）-α-L-鼠李吡喃糖基（1→2）-α-L-阿拉伯吡喃糖苷。

关键词：无患子;皂苷;分离;抗稻瘟病病菌活性

中图分类号： S435.111.4+1;S482.2+92  文献标志码： A  文章编号：1002-1302（2019）10-0127-04

无患子（Sapindus mukorossi）正如其名的含义“无病之果”，该植物有着广泛的药用价值，果实可治疗过度流涎、丘疹、癫痫、萎黄病、偏头痛、湿疹、牛皮癣等，种子粉可治疗龋齿、关节炎、普通感冒、便秘、作呕等，种子可去皮肤黄褐色和雀斑、清洗皮肤油性分泌物、制洗发剂等，叶可用于浴池减缓关节痛，根可治疗痛风、风湿病等[1]。已发现无患子提取物具有抑制光滑念珠菌、白色念珠菌、热带念珠菌[2]、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、大肠杆菌、普通变形杆菌、幽门螺旋杆菌等细菌的活性，而且幽门螺旋杆菌等菌不会对该提取物产生抗性[3]，还可以抑制黑曲霉[4]、苜宿炭腐病病菌和黄连白绢病病菌（EC50为181～407 μg/mL）[5]等的活性。研究发现，无患子中果皮总皂苷提取物具有强烈抑制稻瘟病病菌的活性，而无患子皂苷种类丰富，其中果实中含有13种五环三萜类齐墩果烷型皂苷[5-9]，根中含有2种五环三萜类甘遂烷型皂苷[10-11]，虫瘿中含有7种达玛烷型皂苷和5种甘遂烷型皂苷[12-13]，而且新的皂苷还在不断地被发现[14]。为了寻觅其生防活性皂苷先导物，本试验对其进行分离探索，并进行色谱光谱定性定量分析以及活性跟踪。

1 材料与方法

1.1 材料和仪器

本试验于2017年在江西农业大学江西省菌物资源保护与利用重点实验室开展。无患子中果皮浸膏由南昌市生物资源保护与利用重点实验室制备[15]。

GF254薄层硅胶板，购自山东省烟台市芝罘化工厂;D101型大孔树脂，购自天津市南开大学化工厂;柱层析用硅胶（精致型），购自青岛海洋化工厂分厂。高效液相色谱仪，购自Waters公司;核磁共振波谱仪，400 MHz NMR波谱仪，购自Bruker公司;UPLC-ESI-QTOF质谱仪，购自安捷伦科技公司。

1.2 试验方法

1.2.1 大孔吸附树脂初分无患子抗稻瘟病病菌活性成分 醇洗脱梯度的选择：吸取15 mL无患子浸膏的正丁醇萃取物，缓慢上样至D101型大孔吸附树脂柱中，依次用2倍柱体积（BV）的体积分数为0、30%、50%、70%、95%的乙醇水溶液过柱，流速为2 mL/min，收集各流分。分别测定各流分的皂苷含量、固形物含量以及抗稻瘟病病菌活性。

洗脱剂用量的确定：吸取15 mL正丁醇萃取物，缓慢上样至D101型大孔吸附树脂柱中，依次用蒸馏水、30%乙醇、70%乙醇、95%乙醇各4 BV洗脱。以1 BV/份收集流分，测定各流分中固形物含量和无患子皂苷的含量。

1.2.2 硅胶柱色谱分离无患子抗稻瘟活性成分 称取90 g 200～300目的硅胶，用三氯甲烷浸泡24 h后，湿法装柱。量取10 mL经大孔吸附树脂洗脱的70%流分，分别按三氯甲烷、甲醇体积比为9 ∶ 1、7 ∶ 1、5 ∶ 1、3 ∶ 1进行梯度洗脱，每个梯度2 BV，每50 mL洗脱液收集1份。蒸干后，测定各洗脱流分在浓度为50 μg/mL时对稻瘟病病菌的抑菌活性。

1.2.3 皂苷成分分析及波譜数据测定 薄层色谱分析（TLC）检测：将过硅胶柱后的各流分用毛细管点样于薄层板上，点样后用吹风机吹干，然后放入加有三氯甲烷和甲醇体积比为7 ∶ 3的展开剂层析缸中，封上盖子，待展开至距离薄层板顶端1 cm左右时取出，用吹风机吹干，然后喷上10% H2SO4溶液，加热显色。

高效液相色谱分析（HPLC）检测：将过硅胶柱后的各流分减压浓缩，冷冻干燥至干，分别称取少量样品，用色谱纯级的甲醇溶解，过0.45 μm滤膜，然后以乙腈和水为流动相，梯度洗脱，检测无患子皂苷的纯度。色谱柱为C18柱，4.6 mm×150 mm;柱温为25 ℃;检测波长为205 nm;流动相：A泵是乙腈，B泵是水。梯度洗脱程序为0～5 min，30% A;5～6 min，30%～50% A;6～40 min，50%～70% A;40～60 min，70%～100% A。流速为2 mL/min;进样量为20 μL。

核磁谱图在Bruker公司400 MHz NMR波谱仪上测定，以四甲基硅为内标物，化学位移单位为10-6，耦合常数单位为Hz。

1.2.4 皂苷含量的定量分析 标准曲线的绘制：称取 10.0 mg 干燥的齐墩果酸，用甲醇溶解并定容至10 mL，备用;称取0.500 0 g香草醛，用冰乙酸溶解并定容至10 mL，备用;分别吸取齐墩果酸甲醇溶液0、40、80、120、160、200、240 μL于比色管中，每组3次重复，水浴加热挥去溶剂，先后加入 0.4 mL 配好的香草醛-冰醋酸溶液，1.4 mL高氯酸（氧化剂），充分摇匀，于70 ℃水浴加热20 min，取出后立即浸入冰水浴中冷却2～3 min，加入10 mL冰乙酸，在546 nm波长处测定其吸光度[16]。用移液枪吸取一定体积的分离液，测定样品分离液的吸光度（用标准曲线法），以不加提取液为空白对照，计算提取液中的皂苷含量。

1.2.5 抗稻瘟病病菌活性测定 将水稻稻瘟病病菌接种到PDA培养基上，28 ℃培养7 d，备用。用直径为7 mm的打孔器打取菌落边缘的菌块作为接种物，分别接种预先制备的含不同浓度无患子皂苷的PDA平板上，每个处理3次重复，培养7 d后采用十字交叉法测定菌落大小，并算出抑菌率：

抑菌率=（空白菌落直径-含药菌落直径）/（空白菌落直径-接入菌块直径）×100%。

2 结果与分析

2.1 大孔吸附树脂对无患子皂苷的初步分离效果

2.1.1 不同浓度乙醇水溶液的洗脱分离效果 由表1可知，无患子粗皂苷经D101大孔吸附树脂分离后，其皂苷主要集中于70%、50%、95%乙醇洗脱液中，蒸馏水和30%乙醇洗脱液中虽然有一定的固形物存在，但并未检测出皂苷，这说明其中的固形物有可能是糖类等水溶性杂质。因此，蒸馏水和低浓度乙醇可以用来除掉无患子粗皂苷中的杂质。

2.1.2 洗脱剂用量对分离效果的影响 由表2可知，在用 3 BV 的蒸馏水洗脱时，已经能将萃取物中的水溶性杂质除尽，再继续用蒸馏水洗脱，则没有物质被洗脱下来;30%乙醇洗脱用量至3 BV时，在流分中未检测到无患子皂苷，当用量达到4 BV时，开始有无患子皂苷，说明无患子皂苷随着30%乙醇用量的增加，已有部分被解吸，因此，30%乙醇的用量确定为3 BV;当70%乙醇的用量为4 BV时，已经能够洗下所有皂苷。因此，选择D101大孔吸附树脂纯化无患子皂苷的工艺为蒸馏水和30%乙醇各3 BV，70%乙醇4 BV，依次洗脱，收集70%乙醇洗脱液。由表3可计算出，70%乙醇流分抗稻瘟病病菌的毒力方程为y=2.220 0x+1.390 8（r2=0.987 2，P=0.001 7），EC50=42.245 4 μg/mL，EC90=159.610 0 μg/mL。

2.2 硅胶柱色谱对无患子皂苷的分离效果

2.2.1 硅胶柱不同比例二元洗脱剂洗脱的无患子皂苷流分的抗稻瘟病病菌活性 由表4可知，三氯甲烷与甲醇二元洗脱剂的体积比为5 ∶ 1、7 ∶ 1时，其EC50较小，分别为 23.132 5、29.918 7 μg/mL，而其他体积比的EC50均高于 40 μg/mL，说明主要活性物质可能在这2个流分中。另一方面，EC90似乎表现出极性越弱的流分活性越强的趋势，即含糖基越少的无患子皂苷活性越强。

2.2.2 硅胶柱不同比例二元洗脱剂洗脱的无患子皂苷流分的色谱结果 由图1可知，大孔吸附树脂70%乙醇流分所含皂苷成分较多，至少有5个化合物。经过硅胶柱层析，各比例三氯甲烷和甲醇洗脱后，能够得到有效分离。1 ∶ 1和3 ∶ 1流分似乎成分相对单一，但活性较弱，而活性较强的5 ∶ 1流分似有3个成分，7 ∶ 1、9 ∶ 1流分均有2个以上化合物。

2.2.3 无患子皂苷的纯化及其抗稻瘟病菌活性 向5 ∶ 1流分的三氯甲烷-甲醇溶液中加入蒸馏水，有白色絮状物出现，离心收集白色絮状物，弃去上清液，获得了白色粉末状成分，经色谱纯甲醇溶解沉淀，HPLC检测，获得了含有2个主峰的混合物A（图2-a）。将7 ∶ 1流分重新上硅胶柱，进一步细分三氯甲烷和甲醇的比例，得到了白色晶体状物质，经HPLC检测，获得1个单体化合物B（图2-b）。2个物质在浓度为 20 μg/mL 时，对稻瘟病病菌的抑制率分别为81.24%（图2-c）、84.16%（图2-d）。

2.3 活性无患子皂苷的鉴定

活性无患子皂苷单体的结构式如图3所示，为白色晶状单体。1H-NMR（400 MHz，MeOD）δ 0.73，0.84，0.93，0.96，0.99，1.20（3H，each，all s，24，26，29，30，25，27-H3），1.63（1H，m，9-H），1.90（1H，m，11-H），2.86（1H，dd，J=17.03，9.30 Hz，18-H），3.28，3.22（2H，both d，J=11.03，23-H2），3.64（1H，dd，J=6.32，4.10 Hz，3-H），4.47（1H，d，J=7.2 Hz，1″-H），4.50（1H，d，J=6.88 Hz，1′-H），5.16（1H，t，12-H），5.22（1H，brs，s，1″-H）。13C-NMR（101 MHz，MeOD）δ 182.31，145.21，123.26，106.34，104.51，101.16，82.11，81.92，77.42，76.00，75.04，74.01，72.73，71.43，70.87，69.72，69.65，66.94，65.31，64.39，47.95，47.93，47.55，47.13，43.76，42.79，42.59，40.30，39.47，37.42，34.76，33.7，33.41，33.22，31.42，28.67，26.38，26.27，24.32，23.91，23.82，18.62，17.84，17.81，16.20，13.60。HR-ESI-MS：m/z 882.497 7[M+H]+（calcd for C46H74O16，882.497 7）。與文献比对该单体的结构被确定为常春藤3-O-α-D-木吡喃糖基（1→3）-α-L-鼠李吡喃糖基（1→2）-α-L-阿拉伯吡喃糖苷。

3 结论

无患子中果皮总皂苷浸膏正丁醇溶出物经 D101 大孔树

脂的70%乙醇水溶液洗脱，洗脱物再经硅胶柱层析，分别收集三氯甲烷和甲醇体积比为5 ∶ 1、7 ∶ 1的流分，前者水洗后离心析出的白色粉末状为含2个成分的混合物，后者进一步过硅胶柱，细分二元洗脱剂流分，获得白色晶状单体。这2个成分的混合物和单体在浓度为20 μg/mL时，抗菌率分别为81.24%、84.16%。经鉴定，该单体无患子皂苷结构为常春藤3-O-α-D-木吡喃糖基（1→3）-α-L-鼠李吡喃糖基（1→2）-α-L-阿拉伯吡喃糖苷。该皂苷成分为无患子抗稻瘟病菌活性先导物之一。

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