胡灿 刘峰 王运生

摘要：为了初步研究辣椒（Capsicum annuum L.）NRAMP家族基因在重金属镉胁迫下的表达情况，通过生物信息学方法从辣椒基因组中鉴定出NRAMP基因，并对这些基因的序列结构、系统进化树、表达谱等进行系统分析。结果表明，辣椒中含有5个具有典型NRAMP结构域的基因，根据其在染色体上的位置，分别将其命名为CaNRAMP1～CaNRAMP5，根据系统进化分析，将辣椒的NRAMP基因分为2类，Ⅰ类包含2个基因（CaNRAMP1、CaNRAMP3），分别含有10、12个内含子，Ⅱ类包含3个基因（CaNRAMP2、CaNRAMP4、CaNRAMP5），均含有3个内含子。基于基因组织表达模式的分析结果表明，CaNRAMP1在不同组织中均未检测到其表达;CaNRAMP5的表达集中在花器官，其余CaNRAMP基因均有不同的表达模式;通过逆转录定量PCR（qRT-PCR）分析发现，辣椒苗期中的叶片经过镉处理后，CaNRAMP3基因呈明显上调的趋势，参与镉胁迫反应的正向调控，其他基因则不参与镉胁迫反应的调控。研究结果为进一步分析辣椒NRAMP基因家族的功能奠定了基础。

关键词：辣椒;NRAMP基因家族;生物信息学;基因表达

中图分类号： S641.301  文献标志码： A  文章编号：1002-1302（2019）10-0069-06

辣椒（Capsicum annuum L.）为茄科辣椒属一年或有限多年生草本植物。2016年我国辣椒的种植面积超过133.33万hm2，占世界辣椒种植面积的35%，经济总产值超过700亿元，产值和效益位居蔬菜作物前列。NRAMP（natural resistance associated macrophage protein，天然抗性相关巨噬细胞蛋白）家族蛋白是一类广泛存在于生物界、能转运不同金属离子的跨膜蛋白家族，它们对于调控和维持生物内金属离子的稳态发挥着重要作用。NRAMP家族蛋白采用质子共运输方式，参与铁离子（Fe2+）、锰离子（Mn2+）、锌离子（Zn2+）、铜离子（Cu2+）、镉离子（Cd2+）、镍离子（Ni2+）、钴离子（Co2+）、铝离子（Al3+）、砷离子（As3+）等不同金属离子的运输[1-4]。NRAMP首先于哺乳动物巨噬菌细胞内被发现，因其能增加对胞内寄生物的敏感性而得名[5]。随后，NRAMP同源基因被证实存在于细菌、酵母、藻类和动植物中[1]。研究发现，NRAMP在不同物种中高度保守，一般具有10～12个典型的跨膜结构域、1个胞质外转运蛋白特征结构域[6]。

目前，研究者已经在拟南芥、水稻等植物中进行了NRAMP基因的克隆与功能鉴定，发现植物NRAMP家族蛋白基本定位于质膜和液泡膜上，主要在根、芽中表达，参与一些必需营养元素的转运和调控[7]。拟南芥中的AtNRAMP1对植株从土壤中吸收Fe2+、Mn2+发挥着重要作用[8-9]。AtNRAMP3在低Fe2+环境下于植株维管束中表达，可能参与Fe2+的长途运输[10]。AtNNRAMP3/4可以从拟南芥种子液泡中转运Fe2+供幼苗在低Fe2+环境下萌发生长[11]。水稻OsNRAMP3通过调控植物体内和外界的Mn2+浓度，从而使植株正常生长[12]。此外研究也发现，NRAMP家族蛋白同样参与有毒重金属的吸收和转运，在提高植物的抗性方面发挥着重要作用。拟南芥的AtNRAMP1/3/4在酵母中异源表达时具有转运Fe2+、Mn2+、Cd2+的相关能力[11，13]。AtNRAMP6对Cd2+敏感并能调节Cd2+在拟南芥和酵母细胞内的分布[14]。水稻OsNRAMP1在拟南芥的木质部中表达时可以转运和积累Cd2+、As2+[4，15-16]。OsNRAT1（OsNRAMP4的同源物）和OsNRAMP5分别是植株内Al3+和Mn2+、Cd2+的主要运输载体[3，17]。另外，在一些特殊植物如超富集植物遏蓝菜（Thlaspi caerulescens）中，发现TcNRAMP3/4在酵母中异源表达时都能转运Fe2+、Mn2+、Cd2+，并且TcNRAMP 4大都具备转运Zn2+的能力[18]，但是TcNRAMP3/4蛋白除了比拟南芥的同源蛋白AtNRAMP3/4的表达程度更高外，在功能上并无明显区别。

2014年，Qin等对栽培辣椒品种遵辣1号及其野生祖先进行了基因组测序，从而为辣椒的分子生物学研究奠定了良好基础[19]，但是关于辣椒中的NRAMP基因是否参与重金属镉的转运却鲜有报道。本研究利用生物信息学方法，对辣椒的NRAMP基因家族进行鉴定，并通过逆转录定量PCR（qRT-PCR）分析辣椒苗期叶片在镉胁迫下相应基因家族的表达情况，以期为辣椒NRAMP基因的镉运输功能研究和耐性品种选育提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验材料为辣椒Zunla-1号，由湖南省农业科学院蔬菜研究所提供。将辣椒种子消毒后进行催芽处理，种植于穴盘中，置于光照培养箱内，培养温度周期为27 ℃—20 ℃，光—暗周期为14 h—10 h，在幼苗有4～6张真叶时，选择长势整齐的幼苗进行重金属Cd2+胁迫处理（100 μmol/L），叶片样品分别设置0、3、6、12、24 h 5个时间点进行处理，每次测试取7株样品，设3次重复，取样后立即放于液氮中速冻并置于 -80 ℃ 冰箱中待用。

1.2 辣椒NRAMP基因家族成员的鉴定与序列分析

辣椒全基因组数据从Zunla-1基因组数据库（http：//peppersequence.genomics.cn）中获得，利用Pfam数据库中的NRAMP隐马尔可夫模型搜索辣椒NRAMP家族蛋白。候选基因利用MEGA 6.0提供的Clustal W工具去除重复序列[20]，在Pfam网站（http：//pfam.xfam.org/search）上进行NRAMP结构域的鉴定。借助Expasy网站（http：//web.expasy.org/protparam/）获得辣椒NRAMP蛋白序列相关信息，在ProtComp网站（http：//www.softberry.com）上分析相应蛋白的亚细胞定位，通过GSDS网站（http：//gsds.cbi.pku.edu.cn）获得NRAMP基因的结构[21]。利用生物学软件DNAMAN 8.0进行辣椒NRAMP结构域序列的多重比对，通过MEME网站（http：//meme-suite.org/tools/meme）進行基序（motif）分析，参数设计如下：基序长度为6～50个，保守基序最大为15;其他参数为默认值。

采取同源搜索法从NCBI（美国国立生物技术信息中心）官网（http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov）上下载拟南芥、水稻、大豆、苜蓿、番茄的NRAMP家族蛋白相关序列，借助工具MEGA 6.0，采用邻接法构建相关系统进化树，自举（Bootstrap）检测次数为1 000次，其他均为默认设置。从NCBI网站上下载辣椒遵辣一号（Zunla-1）的不同组织和果实发育各时期的转录组测序技术（RNA-seq）数据，利用Tophat、Cufflink软件进行转录组表达的差异分析，运用R软件绘制NRAMP基因的表达热图。

1.3 总RNA的提取和qRT-PCR分析

参考张亚利等的研究方法[22]，按照Biospin多糖多酚植物总RNA提取试剂盒（北京博迈斯科技发展有限公司）的操作方法提取叶片总RNA，利用RNA逆转录试剂盒（TaKaRa公司）反转录成cDNA。按照SYBR Premix Ex TaqTM IIMix（TaKaRa）试剂盒的操作方法进行qRT-PCR试验，利用ABI 7000实时荧光定量PCR仪（ABI Prism，美国）检测表达量。以β-actin为内参基因，利用DNAMAN 8软件设计特异性引物。设3个技术重复，使用2-ΔΔCT法计算相对表达量[23]。

2 结果与分析

2.1 辣椒NRAMP基因家族的鉴定

通过生物信息学方法，从辣椒全基因组中得到8个候选基因，剔除不含有NRAMP典型结构域的蛋白，获得5个辣椒NRAMP基因。根据基因在染色体上的排列顺序，分别命名为CaNRAMP1～CaNRAMP5（表1），其中1个基因在染色体上的位置未知，在染色体2和染色体3上各有1个基因，在染色体4上有2个基因。辣椒NRAMP基因编码蛋白质的长度范围为468 aa（CaNRAMP1）～541aa（CaNRAMP4），分子量范围为50.77 ku（CaNRAMP1）～58.95 ku（CaNRAMP4），等电点介于（CaNRAMP4）5.54～8.82（CaNRAMP3）之間。

2.2 辣椒NRAMP蛋白的结构域与保守基序分析

通过DNAMAN 6.0对辣椒CaNRAMP的蛋白成员进行序列比对。由图1可以看出，CaNRAMP1与CaNRAMP3的序列相似性为50%，CaNRAMP2与CaNRAMP4、CaNRAMP5的序列相似性分别为69%、67%，说明CaNRAMP蛋白成员之间存在较高的保守性。

利用在线工具MEME进一步分析辣椒NRAMP蛋白的保守基序，在15个基序中，基序1、2、4、5、6、9出现在所有成员中（图2）。基序1位于TMD8、TMD9及胞质内转运结构域（CTM）区，其CTM-GQSSTI（/M）TGTYAGQF（/Y）I（/V）MG（/Q）GFLD（/H/N）是最长基序和最大的严格保守区域;基序2位于TMD1、TMD2及其中的区域，包含TMD1的严格保守氨基酸残基天冬氨酸-脯氨酸-甘氨酸-天冬酰胺（Asp-Pro-Gly-Asn，简称DPGN）、甘氨酸-脯氨酸-甘氨酸-苯丙氨酸-亮氨酸（Gly-Pro-Gly-Phe-Leu，简称GPGFL）;基序5位于TMD6及其中的区域，包含位于TMD6的严格保守氨基酸残基脯氨酸-组氨酸-天冬酰胺（Pro-His-Asn，简称PHN）、丝氨酸-丙氨酸-亮氨酸-缬氨酸（Ser-Ala-Leu-Val，简称SALV）;基序4、6、9也相应地包含一些严格保守的氨基酸残基。总之，上述结果说明，辣椒的NRAMP蛋白结构具有高度的保守性，其中严格保守残基可能在NRAMP蛋白行使转运金属离子的功能中发挥重要作用。此外，辣椒CaNramp1丢失了部分基序，这可能导致相应基因成为假基因或者失去了转运金属离子的功能。

2.3 辣椒NRAMP基因的系统发育树分析

通过MEGA 6.0对辣椒与拟南芥AtNRAMP（6个）、水稻OsNRAMP（7个）、大豆GmNRAMP（8个）、苜蓿MtNRAMP（7个）、番茄LeNRAMP（3个）中已报道的NRAMP蛋白序列进行聚类分析。由图3可以看出，6种植物的NRAMP基因家族成员可以分为2大类（Ⅰ和Ⅱ），分别包含2、3个辣椒相关基因。Ⅰ类中辣椒的CaNRAMP1与番茄的LeNRAMP1，Ⅱ类中辣椒的CaNRAMP2、CaNRAMP4分别与番茄的LeNRAMP3、LeNRAMP2为直系同源基因;大豆与苜蓿也有2对直系同源基因。由以上结果可知，同科植物间的NRAMP基因进化关系更近。而大豆（假多倍体植物）有4对旁系同源基因，说明大豆的NRAMP基因非常保守且扩张，可能是由染色体基因组的复制造成的[24]。另外，在植物NRAMP基因成员聚类中，Ⅰ类基因中一般含有10～12个内含子，Ⅱ类中一般含有3个内含子，这种高度相似的外显子-内含子结构揭示了植物NRAMP基因家族的进化保守性;同时NRAMP基因在内含子数量或长度上都有不同的进化，表明Ⅰ类NRAMP基因在进化上更加复杂和具有多样性，而Ⅱ类NRAMP基因更趋向于保守。

2.4 辣椒NRAMP基因家族的组织表达模式

为了分析辣椒NRAMP基因的表达模式，从NCBI中获取Zunla-1不同组织（根、茎、叶、花蕾、花）及果实发育各时期的RNA-seq数据，结果未检测到CaNRAMP1基因的表达信号。由图4可以看出，CaNRAMP5在花蕾、花中具有中等丰度的表达，其余3个基因各有不同组织的表达模式。在不同组织中，CaNRAMP2的表达量在花蕾中最高，然后依次是根、花和茎中的表达量，在叶中的表达量相对最低;CaRAMP3的表达量在花中最高，其后依次是叶和根，在茎、花蕾中的表达量相对最低;CaNRAMP4的表达量在根中最高，其后依次是在茎、花蕾中的表达量，在花、叶中的表达量相对最低。此外，本研究结果显示，CaNRAMP2、CaNRAMP3、CaNRAMP4全程参与果实发育阶段的调控，其中CaNRAMP2、CaNRAMP4的表达量分别在绿熟果期、破色期最高，CaNRAMP3的表达量在绿熟果期最低，在破色期的表达量迅速上升到最高值，而CaNRAMP5仅在果实发育前期少量表达。

2.5 辣椒幼苗在镉胁迫下NRAMP基因的表达分析

利用qRT-PCR分析辣椒叶片中NRAMP家族基因在100 μmol/L Cd2+处理后不同时间点的表达情况，结果未检测到CaNRAMP1基因表达信号。由图5可以看出，在Cd2+胁迫下，CaNRAMP2、CaNRAMP4基因在叶片中的相对表达量分别呈现缓慢上升、缓慢下降的表达趋势，但在各个时间点间没有明显变化。CaNRAMP3基因在处理0～12 h呈明显的上调趋势，在处理12 h时表达量最高，为处理0 h时表达量的6.68倍;处理24 h时表达量有所减弱，但仍为处理0 h时表达量的3.26倍。CaNRAMP5基因在处理3～24 h的表达量整体呈下降趋势，处理12 h时的表达量最低。结合基因组织表达热图可以看出，CaNRAMP3基因参与镉胁迫反应的正调控，而CaNRAMP2、CaNRAMP4、CaNRAMP5基因不参与镉胁迫反应的调控。

3 讨论与结论

NRAMP家族蛋白是一類能在生物中转运不同金属离子的跨膜蛋白家族，在植物基本营养元素（Mn2+、Fe2+、Zn2+等）的吸收和抵御重金属（Cd2+、Co2+、As2+等）毒害等方面发挥着重要作用。目前 人们已在拟南芥、水稻、大豆、苜蓿、番茄等植物中发现相关NRAMP家族蛋白，本研究也从辣椒中鉴定出5个NRAMP相关基因，根据系统进化关系，将6个植物中的NRAMP家族蛋白分为2大类。植物Ⅰ类NRAMP蛋白成员参与Fe2+、Mn2+、Cd2+等金属离子的运输。拟南芥AtNRAMP1、番茄LeNRAMP1、水稻OsNRAMP1、苜蓿MtNRAMP1分别在缺Fe2+环境下于各植物根部的表达量上调[8，25-26];部分水稻、拟南芥的NRAMP蛋白也参与到Mn2+、Cd2+的转运和调节中[6，9，12，17]。而在植物Ⅱ类NRAMP蛋白成员中，也同样具有部分金属离子转运的功能，AtNRAMP3、AtNRAMP4定位在拟南芥种子液泡中，参与Fe2+的运输，在叶片中也参与Mn2+的转运[11-12];部分大豆的NRAMP蛋白被预测定位在液泡上，发现具有转运Mn2+、Cd2+、Cu2+的能力[27]。此外，在植物NRAMP蛋白成员中，Ⅰ类成员已被证实或预测定位于细胞质膜上，而Ⅱ类则被证实或存在于液泡膜上。这些研究结果表明，植物NRAMP同类成员之间可能有着相同的亚细胞定位，行使着类似的金属离子转运功能。

本研究对辣椒NRAMP基因的组织表达模式和qRT-PCR的分析结果显示，均未检测到CaNRAMP1基因的表达情况;CaNRAMP5的组织表达特异地集中于花蕾、花中，在叶中不表达，可能在花器官的发育过程中起重要作用;CaNRAMP2、CaNRAMP3、CaNRAMP4可能全程参与辣椒各生长发育阶段的调控。在辣椒苗期叶中应对镉胁迫处理时，CaNRAMP3基因的表达量有明显上调趋势，其余基因表达量皆无上调变化，说明CaNRAMP3参与镉胁迫的正向调控，推测CaNRAMP3在叶中参与了Cd2+的转运调控。CaNRAMP2、CaNRAMP4在根、茎中均有中较高的组织表达量，研究也发现，CaNRAMP2的直系同源基因LeNRAMP3在番茄根部可以转运Fe2+、Cd2+[23，28]，CaNRAMP4的直系同源基因LeNRAMP2在番茄木质部可以转运Zn2+[29]，预测这2个CaNRAMP基因在辣椒中可能具有类似的金属离子转运功能。

本研究通过生物信息学方法，在辣椒全基因组中鉴定了辣椒NRAMP基因家族，并对其序列结构、系统发育关系及表达情况进行了分析，对辣椒NRAMP基因成员在生长发育和Cd2+胁迫下的应答功能进行了初步预测。通过对辣椒NRAMP基因家族成员的全面了解，将有助于研究辣椒如何适应外界的镉胁迫，可以为降低辣椒中镉的积累量和优化作物品质提供参考。

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