侯宇奇 李贞景 翟雨佳 谢彩梅 武淑芬 王昌禄

摘要：为研究GA20氧化酶基因在蓖麻中的表达情况，以具有典型代表的4种高秆和4种矮秆蓖麻品种为材料，采用实时定量PCR和荧光定量PCR技术，对GA20氧化酶基因在蓖麻的不同器官及器官发育的不同阶段的表达特异性进行分析。结果表明，蓖麻的矮化不是由GA20氧化酶基因的突变所引起;GA20氧化酶基因在种子和嫩叶中的表达量最高，在成熟叶中可大量表达，在茎中可微量表达，在根中可痕量进行表达;同一生长时期，高秆品种的GA20氧化酶基因表达量明显高于矮秆品种，不同生长时期高秆品种GA20氧化酶基因的表达量呈现由高到低再升高的变化趋势，而矮秆蓖麻GA20氧化酶基因的表达量始终处于相对较低水平。该研究结果为进一步阐明蓖麻GA20氧化酶基因的功能特征及揭示其参与调控植物生长的分子机制提供了参考。

关键词：GA20氧化酶;RT-PCR;荧光定量PCR;表达量

中图分类号： S565.601  文献标志码： A  文章编号：1002-1302（2019）10-0059-04

蓖麻（Ricinus communis L.）是一种经济潜力十分巨大的工业油料作物，是世界十大油料作物之一，具有极高的应用价值和巨大的经济前景[1]。以蓖麻籽为原料生产的蓖麻油具有性能稳定、不易变性等特点，在极端温度环境下仍能保持原有的燃烧特性。此外，蓖麻油是目前羟基脂肪酸的唯一来源[2]，以蓖麻油为基础原料的深加工产品多达3 000多种，广泛用于航空、纺织、环保、医药等领域[3]。然而，我国主推种植的蓖麻品种绝大多数属高秆品种，因植株高大，单位面积单株数过少且抗倒伏性较差，使我国蓖麻种植面临的机械化收割困难和种植效益低下等问题日益突出，影响了农民种植蓖麻的积极性，使我国蓖麻原料的供应不足，成为严重制约我国蓖麻产业健康发展的瓶颈[4]。

实践证明，矮化育种是解决蓖麻种植业发展瓶颈的有效途径之一。通过植株适当矮化，改善株型，增大群体结构，能够提高植物光合效率等能力[5]。赤霉素（gibberellins，简称GAs）是一类普遍存在于高等植物体内的类四环二萜羧酸，在促进植物生长发育过程中起重要作用[6]。GA20氧化酶是赤霉素生物合成中最重要的限速酶之一[7]，其在植物徒长型和矮化型突变体内的表达量存在很大的差异。因此，GA20氧化酶家族基因常被用于植物矮化基因工程育种和降低植物内源GAs水平的生理效应研究中[8]。

国外水稻GA20氧化酶基因研究表明，正义转化表现出植株增高，反义转化表达植株明显“矮化”[9-12]。国内也有报道指出，GA20氧化酶功能缺失的突变体具半矮生的表型，而过量表达GA20氧化酶能导致赤霉素的过量合成和明显加快植株生长。通过RNAi抑制水稻中OsGA20氧化酶基因表达，能导致水稻内源GA1含量减少并使植株矮化[13]。上述赤霉素及GA20氧化酶的研究，为矮化型转基因蓖麻植株的培育奠定了基础，但针對蓖麻种的GA-20氧化酶基因的研究还处于初级阶段，相关报道较少。

本研究以蓖麻为材料，采用实时定量PCR和荧光定量PCR技术对GA20氧化酶基因在不同高矮蓖麻植株中的不同器官及器官发育不同阶段的表达特异性进行了初步研究，为最终利用转基因技术实现蓖麻矮化育种提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验于2014年3月至2015年11月在天津科技大学食品工程与生物技术学院进行。选取8个蓖麻品种，其中高秆品种4个：淄蓖麻5号（市场购买）、蓖绿2号（南开大学蓖麻工程研究中心惠赠）、CSR24.181（购于通辽市农业科学研究院）、浙蓖17号（浙江省农业科学院惠赠）;矮秆品种4个：中北4号、中北5号（购于山西经作蓖麻科技有限公司）、天蓖26号、浙蓖36号（浙江省农业科学院惠赠）。

试验用大肠杆菌（Eschericha coli）DH5α菌株，购自Takara（宝生物工程大连有限公司）;根癌农杆菌（Agrobaoterium tumefaciens）EHA105菌株，由中国农业科学院油料作物研究所惠赠;克隆载体（pUC-T Vector）购自康维世纪生物科技有限公司;Plant RNA Kit试剂盒购自OMEGA公司;pBI-121双元表达载体、pHANNIBAL载体由笔者所在实验室保存。

1.2 试验方法

1.2.1 GA20氧化酶基因组织特异性表达分析 提取淄蓖麻5号蓖麻品种的种子、根、茎、嫩叶、成熟叶等器官的总RNA，反转录合成cDNA，以各器官的cDNA为模板，以蓖麻Actin基因作为内参基因，以表1中的引物进行半定量RT-PCR分析。构建反应体系，扩增程序为95 ℃ 5 min;95 ℃ 30 s，55～60 ℃ 30 s，72 ℃ 60 s，35个循环;72 ℃延伸10 min。利用1%琼脂糖凝胶电泳检测，分析GA20氧化酶基因在不同器官表达模式。

1.2.2 不同品种蓖麻GA20氧化酶基因编码区比较 提取4个典型蓖麻矮秆品种中北4号、中北5号、天蓖26号、浙蓖36号，以及4个典型蓖麻高秆品种蓖绿2号、淄蓖麻5号、CSR24.181、浙蓖17号叶片的总RNA，反转录合成cDNA。根据目的基因设计特异性引物（F：5′-ATGGCAATAGAGTGCATCAA-3′和R：5′-CTACTTTCTCTGTTGAACCC-3′）。分别以8个不同品种的cDNA为模板，对其GA20氧化酶基因的编码区进行PCR扩增，反应体系及扩增程序同“1.2.1”节，PCR扩增产物经1%凝胶琼脂糖电泳检测分析。对8个品种扩增得到的PCR产物进行纯化回收，将回收的PCR产物送至北京奥科鼎盛生物科技有限公司测序，测序结果使用DNAMAN软件进行比对分析。

1.2.3 实时荧光定量PCR（real-time fluores-cence quantitative PCR） 对8个蓖麻品种进行播种，以第30天、第60天、第75天、第90天及第105天5个生长时期的新生幼嫩叶片的cDNA为模板，以“中北4号”在第30天的嫩叶cDNA为对照，以蓖麻Actin为内参基因，对8个蓖麻品种在不同时期的GA20氧化酶基因进行相对定量分析。

以蓖麻GA20氧化酶基因的mRNA序列（XM_002510827.1）为模板，依据荧光定量引物的设计原则，通过NCBI的Primer-BLAST设计1对最优的特异性引物GA20-ox B（F：5′-TACTGCGAGGCTATGAGCAC-3′和R：5′-GGATCGCAATGAGGTCCAGT-3′），以蓖麻Actin基因为内参基因，设计内参基因引物Actin B（F：5′-CGAGCAAGAACTTGAGACTGC-3′和R：5′-CTCGTGGATTCCTGCAGCTT-3′）。使用TAKARA公司的SYBR Premix Ex TaqTM Ⅱ进行实时荧光定量PCR试验。

依据试剂盒说明，构建RT-qPCR反应体系，扩增程序为95 ℃ 5 min;95 ℃ 30 s，55 ℃ 60 s，72 ℃ 60 s，45个循环;95 ℃ 30 s，55 ℃ 60 s，95 ℃ 30 s。每个反应3个平行，重复1次。反应完成后，记录试验数据，通过MxPro软件，采用相对定量分析方法中的2-ΔΔCT法，对GA20氧化酶基因的表达量进行分析。

2 结果与分析

2.1 GA20氧化酶基因组织特异性表达分析

分别提取淄蓖麻5号蓖麻的种子、根、茎、嫩叶、成熟叶等不同器官的总RNA进行琼脂糖凝胶电泳，其结果如图1所示。从图1中可以看出，蓖麻不同器官总RNA提取28S、18S条带较完整，经酶标仪检测其D260 nm/D280 nm值均在1.8～2.0之间，质量符合下一步试验要求。

将从不同器官提取的总RNA反转录为cDNA，以cDNA作为模板，进行实时定量PCR分析，结果如图2所示。

从图2中可以看出，在蓖麻的种子、根、茎、嫩叶、成熟叶中GA20氧化酶基因都有表达，但表达水平存在明显差异。GA20氧化酶基因在种子和嫩叶中表达量最高，其次是在成熟葉中可进行大量表达，在茎中可微量表达，在根中有痕量表达。表明GA20氧化酶基因在蓖麻不同器官中具有不同的表达模式。

2.2 不同品种蓖麻的GA20氧化酶基因编码区比较

分别以8个高矮蓖麻品种的cDNA为模板，对蓖麻GA20氧化酶基因的编码区进行PCR扩增，用1%凝胶电泳进行检测，结果如图3所示。

从图3可以看出，8个品种的GA20氧化酶基因扩增效果良好，切胶回收目标条带，可直接进行测序，得到的序列片段长度均为1 137 bp。

将8个蓖麻品种的RcGA20氧化酶基因进行序列比对，其结果如图4所示。从图4可以看出，8个高矮不同蓖麻品种的RcGA20氧化酶基因核苷酸序列中存在少数碱基差异，但所对应氨基酸序列并不存在差异，由此说明，试验使用的中北4号、中北5号、天蓖26号、浙蓖36号这4种典型矮秆蓖麻品种在生长中表现出的矮化现象，不是由于RcGA20氧化酶基因突变所引起的。

2.3 GA20氧化酶基因的实时荧光定量表达分析

选取的5个生长时期的扩增曲线均达到平台期，且扩增效果良好;熔解曲线显示，各扩增条带均只有1个尖锐的峰，没有杂峰出现，说明扩增产物稳定准确，扩增产物单一，没有非特异性扩增，各生长时期的电泳结果良好，得到清晰单一的条带，同样也验证了无非特异性扩增，荧光定量PCR结果可信。从各个时期的电泳图还可以出，8个不同品种在同一个时期的PCR产物电泳条带亮度不一，表明GA20氧化酶基因的表达均存在差别。

采用相对定量分析方法对8个蓖麻品种在不同时期GA20氧化酶基因相对表达分析汇总如图5所示。在蓖麻播种后的第30天、第60天、第75天、第90天及第105天5个时期，4个高秆蓖麻品种的GA20氧化酶基因表达量明显高于4个矮秆蓖麻品种的基因表达量，且与植株高矮表现一致。播种后第30天（生长初期）与播种后第90天（生长旺盛期），高秆蓖麻与矮秆蓖麻品种之间GA20氧化酶基因表达量变化的差异更为明显。在这5个生长时期中，高秆蓖麻品种GA20氧化酶基因的表达量是由高到低再升高的变化趋势，而矮秆蓖麻品种GA20氧化酶基因的表达量都始终处于相对较低的水平。

3 讨论与结论

近年来，随着基因工程技术的不断发展，已经有20～30种高等植物的GA20氧化酶基因被克隆分离鉴定出来，有的已被转化到其他植物体内，相关结果已经对其生物功能及作用机制进行了深入研究和分析[14-15]。

Kang等从正在发育的西瓜种子中克隆得到了GA20氧化酶基因，进一步研究发现，GA20氧化酶基因在西瓜胚株中强烈表达，但在成熟种子中却几乎检测不到GA20氧化酶基因的表达[16]。Vidal等从柑橘中克隆得到GA20氧化酶基因，在顶端和叶片中强烈表达，但在节间、节点和根部只是微量表达[17]。由此可以看出，GA20氧化酶基因在植物体内表达分布上存在着较大差异。

本研究中，在蓖麻的种子、根、茎、嫩叶、成熟叶中GA20氧化酶基因都有表达，但表达水平存在明显差异。GA20氧化酶基因在种子和嫩叶中表达量最高，其次是在成熟叶中高量表达，在茎中微量表达，在根中痕量表达。表明GA20氧化酶基因在蓖麻不同器官中具有不同的表达模式。

Eriksson等将克隆得到的拟南芥GA20氧化酶基因转入杂交杨中使其超量表达，结果显示，转基因植株体内赤霉素含量增多，叶片变大，树体的主干和直径变长[18]。Dayan等将拟南芥GA20氧化酶基因转化烟草使其过表达，发现转基因烟草在早期营养生长时期，茎的高度有很明显提高，并且纤维产量也有很大程度增多[19]。

本研究对8个不同高矮蓖麻品种的GA20氧化酶基因的编码区进行比对分析，证明选取的4种典型矮秆蓖麻品种的矮化不是由于GA20氧化酶基因突变所引起的，采用荧光定量PCR对8个不同高矮品种的不同生长时期GA20氧化酶基因的相对表达量分析表明，高秆蓖麻品种的GA20氧化酶基因表达量明显高于矮秆蓖麻品种的基因表达量，且与植株高矮表现一致。在这5个生长时期，高秆蓖麻品种GA20氧化酶基因的表达量是由高到低再升高的变化趋势，而矮秆蓖麻品种GA20氧化酶基因的表达量都始终处于相对较低的水平。

本研究結果表明，蓖麻的GA20氧化酶基因与其他大多数植物的GA20氧化酶基因功能相似，在赤霉素合成过程中可以催化形成具有生物活性的GAs。这也说明，蓖麻GA20氧化酶基因的表达差异会影响赤霉素的合成，是影响植株表现高矮的重要原因之一。该结果为进一步明确GA20氧化酶基因的功能特征及揭示其参与调控植物生长的分子机制奠定了基础，为利用转基因技术进行矮化蓖麻育种提供了参考。

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