邢宇俊 陆丹丹 吴季荣 王园园 徐剑宏 史建荣

摘要：随着转基因植物研究的迅速发展，转基因农产品的应用也更加广泛。在我国，转基因农产品的来源主要是进口，主要是玉米、大豆，主要用于饲料加工行业。为了调查转基因玉米、大豆在江苏省畜禽饲料市场的分布情况，在江苏省市场抽取40份鸡、鹅和猪饲料以及饲料原料，通过定性PCR检测玉米内标zSSIIb、大豆内标Lectin、花椰菜花叶病毒（CaMV）35S启动子、NOS终止子、Bt、EPSPS基因，同时检测玉米、大豆转化体事件MON810、MON89788、GTS40-3-2和MON87701。结果表明，90%的饲料都含有转基因成分;转基因玉米转化体事件MON810占50%，转基因大豆转化体MON89788、GTS40-3-2、MON87701的检出率都为80%。由研究结果可知，江苏省市场的鸡、鹅和猪饲料及饲料原料中转基因成分的占有率较高，需要进一步加强对饲料原料的转基因监管。

关键词：畜禽饲料;转基因作物;转基因成分检测

中图分类号： S816.17  文献标志码： A  文章编号：1002-1302（2019）10-0052-04

转基因生物（genetically modified organisms，简称GMOs）是指借助于基因工程技术将其他来源的基因转移到植物、动物或微生物的基因组中，使其性状发生改变，如提高抗虫性、营养成分含量或提升耐除草剂性状等，以期达到延长保质期等目的[1-2]。

自从首例转基因产品被批准商业化生产以来，越来越多的转基因作物在不同国家和地区开始被商业化种植，截至2016年，全球种植转基因作物的面积已达到1.85亿hm2。其中种植面积排名前4位是大豆、玉米、棉花、油菜，分别占全球转基因作物种植面积的50%、33%，12%、5%[3]。在我国允许进口的46种转基因农产品中，转基因大豆、玉米的品种最多，它们主要被用于饲料加工业中[4-5]。

我国对于饲料粮的需求缺口非常大，在全球粮食危机的背景下，我们不能单纯地使用非转基因粮食作为饲料加工原料，而应将非转基因作物用于满足饲料工业。由于江苏省的畜禽養殖业比较发达，对饲料原料的需求量较大，因此，可以带来高附加值的转基因作物成为饲料生产的首要选择。

对大豆、玉米开展转基因检测，通常检测的外源基因包括大多数转基因产品中使用的花椰菜花叶病毒CaMV35S启动子、胭脂碱合成酶NOS终止子、抗虫Bt基因和除草剂EPSPS基因。由于这些序列在大多数转基因产品中存在一种或多种，因此本研究拟选用常规的核酸检测技术PCR方法进行分析[4，6]，同时对阳性样品进行转化体品系的确定。通过对江苏省饲料中转基因成分的筛查，可为政府部门对饲料业的转基因监管提供数据，也可为江苏省转基因行业的监管提供支撑。

1 材料与方法

1.1 饲料样品

共选取40份饲料，分别由多家公司生产，具体饲料信息见表1。其中包括乳猪浓缩饲料、母猪浓缩饲料、草鸡配合饲料、种鸡配合饲料、鹅饲料等，以及用作饲料原料的麦麸、玉米和豆粕。

1.2 主要试剂

Taq DNA聚合酶、DNA marker、dNTPs，购自TaKaRa宝生物工程（大连）有限公司;引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。其他试剂为实验室常规分析纯试剂。

1.3 方法

1.3.1 PCR引物 根据农业部（现为农业农村部）颁布的标准条例，对饲料样品中含有的内参基因Lectin和zSSIIb，外源基因花椰菜花叶病毒（CaMV）35S启动子、NOS终止子、EPSPS基因、Bt基因以及GTS40-3-2、MON89788、MON87701、MON810转化体特异性序列进行检测。引物序列相关信息见表2。

1.3.2 饲料DNA的提取 称取10 g饲料样品（颗粒性的），在搅拌器中磨碎（颗粒大小应小于2 mm。用十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）法提取DNA[14]。

1.3.3 PCR检测分析 PCR体系：2.5 μL 10×PCR buffer，2.5 μL Mg2+，2 μL dNTPs（2.5 mmol/L），2 μL DNA模板，0.25 μL Taq DNA聚合酶，加水补至25 μL。

Lectin、zSSIIb、 CaMV35S启动子、NOS终止子、Bt、GTS40-3-2、MON89788、MON810、MON87701基因片段的PCR反应条件：95 ℃ 5 min;95 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，35个循环;72 ℃，7 min。EPSPS基因的PCR反应条件：94 ℃ 7 min;94 ℃ 30 s，63 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，5个循环;94 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，30个循环;72 ℃ 7 min。PCR产物用2%琼脂糖检测，通过凝胶成像系统观察基因扩增片段的大小。

2 结果与分析

2.1 饲料中DNA的质量分析

对提取的饲料DNA进行质量和浓度的测定，用核酸蛋白浓度检测仪测定所有样品溶液的浓度，并稀释至40 ng/μL后使用，纯度（D260 nm/280 nm）均在1.7～2.0间，表明提取的DNA浓度和纯度较好，可用于下一步试验。

2.2 定性PCR结果分析

2.2.1 饲料中内参基因的分析 当前饲料的主要来源是玉米和豆粕，通过对饲料中内参基因的分析可以判断饲料的组成部分。通过对40种饲料样品的内参基因Lectin和zSSIIb进行分析发现，混合饲料主要来源于玉米、大豆（本试验也对水稻SPS、油菜HMGI/Y内参基因进行扩增，没有扩增出相应片断）;从豆粕、玉米饲料中分别扩增出对应的内参基因;从麦麸中检测出大豆内参基因（图1）。

2.2.2 饲料中外源基因的筛查 对玉米和大豆及其加工品中的外源基因进行检测，通过对其所有转基因转化体的分析发现，几乎所有的转基因玉米和大豆中含有CaMV35S启动子、NOS终止子、Bt、EPSPS中的1种或几种基因，因此对40份饲料样品中外源基因的筛查选用CaMV35S启动子、NOS终止子、Bt、EPSPS基因进行。图2结果显示，在混合饲料中，36份含有CaMV35S启动子，占总饲料的90%;32份饲料含有NOS终止子，占总饲料的80%;32份饲料含有Bt基因，占总饲料的80%;32份饲料含有EPSPS基因，占总饲料的80%。由此可见，饲料中转基因成分的占比较高。

2.2.3 饲料中所含转基因转化体的验证 根据我国农业部（现为农业农村部）批准进口的转基因转化体品种以及对其外源基因的分析，对其中的转化体品系（转基因玉米MON810与转基因大豆MON89788、GTS40-3-2、MON87701）进行转化体特异性序列扩增比对。由图3可以看出，有20份饲料中含有转基因玉米MON810，占总饲料的50%;32份饲料中都含有转基因大豆MON98788、GTS40-3-2、MON87701，占总饲料的80%。

2.3 40份饲料中转基因成分的分布

由图4对每份样品的分析结果可以看出，扩增检测出大豆Lectin、玉米zSSIIb内参基因的饲料样品，都含有1种或多种外源基因成分;共检测到36份含有转基因成分的饲料，占总数的90%（36/40）;而没有检测出大豆Lectin、玉米zSSIIb内参基因也没有检测到其体他外源基因成分的样品占10%。CaMV35S启动子的检出率为90%（36/40）;NOS终止子的检出率为80%（32/40）;Bt基因的检出率为80%（32/40）;EPSPS基因的检出率为80%（32/40）;转基因玉米转化体事件MON810的检出率为50%（20/40）;转基因大豆MON89788、MON87701、GTS40-3-2的检出率都为80%（32/40）。可见40份饲料样品中转基因饲料的比例较高。

3 讨论

当前种植面积比较大的转基因农作物是玉米、大豆，在我国国内，转基因玉米、大豆的很多转化体已经被批准进口用于饲料加工。在本试验中发现，用于饲料中的麦麸没有检测出任何转基因成分，这是因为转基因小麦商业化生产的比较少，并且国内也不允许转基因小麦进口;另外，24号5%乳猪复合预混料和28号5%产蛋期复合预混料中也不含有任何转基因成分。此外，36份饲料和饲料原料中都含有转基因成分，占比达到90%，可见江苏省畜禽饲料中转基因产品的占有率比较高，江苏省饲料中转基因成分的含量同山西省的情况比较接近，山西省达到了100%[15]，这也说明我国饲料业中转基因产品的占有率很高，检测出的转基因转化体事件是我国批准进口的转基因材料，允许用于饲料加工业。

在本试验中发现，用于饲料原料的玉米颗粒是转基因玉米MON810。而国内转基因作物及其产品的监管主要集中在大田作物、种子行业、食品行业等领域，对饲料原材料中转基因材料的监管力度比较小，而江苏省内饲料中使用转基因产品作为原材料的饲料比例较高，应该加强对转基因原材料的跟踪和监管，以免原材料散落于大田中造成污染，从而保证转基因农产品的合理、合法使用。

参考文献：

[1]Greiner R，Konietzny U. Presence of genetically modified maize and soy in food products sold commercially in Brazil from 2000 to 2005[J]. Food Control，2008，19（5）：499-505.

[2]Arun O O，Yilmaz F. PCR detection of genetically modified maize and soya in mildly and highly processed foods[J]. Current Opiuion in Biotechnology，2011，22（S1）：S96.

[3]James C. Global status of commercialized biotech/GM crops：2016. ISAAA Brief No. 52[Z]. Ithaca，NY：ISAAA，2016.

[4]Forte V T，Di Pinto A，Martino C，et al. A general multiplex-PCR assay for the general detection of genetically modified soya and maize[J]. Food Control，2005，16（6）：535-539.

[5]陈 亮，黄庆华，孟丽辉，等. 转基因作物饲用安全性评价研究进展[J]. 中国农业科学，2015，48（6）：1205-1218.

[6]Miraglia M，Berdal K G，Brera C，et al. Detection and traceability of genetically modified organisms in the food production chain[J]. Food and Chemical Toxicology：an International Journal Published for the British Industrial Biological Research Association，2004，42（7）：1157-1180.

[7]農业部1782号令-3-2012. 转基因植物及其产品成分检测调控元件CaMV35S启动子、FMV35S启动子、NOS启动子、NOS终止子和CaMV35S终止子定性PCR方法[S]. 北京：中国标准出版社，2012.

[8]农业部1861号公告-5-2012. 转基因植物及其产品成分检测CP4-EPSPS基因定性PCR方法[S]. 北京：中国标准出版社，2012.

[9]农业部953号公告-6-2007. 转基因植物及其产品成分检测抗虫转Bt基因水稻定性PCR方法[S]. 北京：中国标准出版社，2007.

[10]农业部1861 号公告-2-2012. 转基因植物及其产品成分检测耐除草剂大豆GTS 40-3-2及其衍生品种定性PCR方法[S]. 北京：中国标准出版社，2012.

[11]农业部2122号公告-16-2014. 转基因植物及其产品成分检测抗虫玉米MON810及其衍生品种定性PCR方法[S]. 北京：中国标准出版社，2014.

[12]农业部1485号公告-6-2010. 转基因植物及其产品成分检测耐除草剂大豆MON89788及其衍生品种定性PCR方法[S]. 北京：中国标准出版社，2010.

[13]农业部2259号公告-7-2015. 转基因植物及其产品成分检测抗虫大豆MON87701及其衍生品种定性PCR方法[S]. 北京：中国标准出版社，2015.

[14]农业部1485号公告-4-2010. 转基因植物及其产品检测DNA提取和纯化[S]. 北京：中国标准出版社，2010.

[15]袁建琴，赵江河，史宗勇，等. 动物饲料中转基因抗草甘膦大豆GTS40-3-2成分的检测[J]. 大豆科学，2016（2）：295-300.