李娟娟 陈晨 张利伟 李妍

缺血-再灌注损伤(ischemia reperfusion injury，IRI)发生于多种视网膜血管性疾病，对其研究一直是眼底病领域的热点及难点。近年来发现IRI主要经历以下过程：急性缺血后的组织损伤出现大量细胞坏死，之后进入延迟损伤期，这个损伤阶段可以持续数天甚至数周，以典型的微循环损伤带来的组织水肿和炎症反应为特征[1]。因此，减少后期血管损伤是治疗IRI性疾病的关键环节。小胶质细胞在IRI微循环损伤中发挥了重要的作用，Ebneter等[2]研究发现，在采用激光诱导视网膜静脉阻塞的动物模型中，阻塞血管周围活化小胶质细胞的密度明显增加。Jolivel等[3]在脑部IRI模型中观察到活化的小胶质细胞可以直接吞噬血管内皮细胞，而造成血管结构的直接损伤。但在视网膜缺血再灌注损伤(retinal ischemia reperfusion injury,RIRI)的动物模型中，活化的小胶质细胞是否对视网膜微循环产生破坏作用，目前报道尚少。本研究建立小鼠RIRI动物模型，检测不同时相活化小胶质细胞的数量、形态、分布情况的变化，探讨活化小胶质细胞在RIRI中与微循环的关系及作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物及分组健康C57BL/6雄性小鼠160只，周龄4～5周，体质量25～28 g，实验前排除眼部异常。实验动物由昆明医科大学动物科提供，实验动物及实验条件均符合《实验动物管理条例》。实验前检查双眼前节和眼底均正常。小鼠左眼不作处理作为正常对照组；右眼建立RIRI模型为RIRI组，RIRI组再分为RIRI后24 h组、48 h组及72 h组，进行RIRI组与正常对照组、RIRI不同时间点组之间比较。

1.2 主要试剂和仪器胎牛血清(美国Gibco公司)；细胞裂解液、抗离子钙接头蛋白(ionized calcium bindingadaptor molecule-1，Iba-1)抗体、同工凝集素(美国Sigma公司)；cDNA逆转录试剂盒(美国Roche公司)；RT-PCR仪(美国Applied Bio-systems公司)；荧光显微镜(日本OLYMPUS公司)。

1.3 动物模型建立RIRI动物模型采用前房灌注法制作[4-7]：腹腔内注射15 g·L-1戊巴比妥钠行全身麻醉，将麻醉成功的小鼠采取俯卧位四肢固定于自制的小鼠固定器上，使用复方托吡卡胺散大瞳孔，30G针头与生理盐水瓶连接，将针头刺入前房并固定，缓慢升高生理盐水瓶使液面高至150 cm，眼压升高至110 mmHg(1 kPa=7.5 mmHg)，眼压升高后可见小鼠角膜逐渐水肿、角膜缘血管闭锁、虹膜颜色变浅，眼底观察可见视网膜血供减少，视网膜血管阻断，实现视网膜缺血。持续60 min后逐渐降低输液瓶高度至动物眼球水平，拔出前房灌注针头，见小鼠角膜逐渐恢复透明、角膜缘血管重新充血、虹膜颜色逐渐恢复，视网膜逐渐恢复红润，实现再灌注。动物苏醒后，回笼饲养。

1.4 检测指标

1.4.1 视网膜冰冻切片免疫荧光染色观察小胶质细胞活化情况制作视网膜冰冻切片，风干后浸入新鲜配制的40 g·L-1多聚甲醛中20 min。PBS漂洗后组织浸入1 g·L-1细胞裂解液(TritonX-100)中处理15 min。体积分数5%驴血清封闭眼球切片 1 h，室温。抗Iba-1抗体(1200)4 ℃冰箱中孵育24 h，羊抗小鼠/兔抗羊/羊抗兔荧光二抗(11000)常温下孵育1 h。用含4’，6-二脒基-2-苯基吲哚(4’，6-diamidino-2-phenylindole，DAPI)的抗荧光淬灭油性封片剂封片。计数各个层次中Iba-1阳性细胞数(即活化小胶质细胞数)，并进行统计分析。

1.4.2 视网膜铺片血管染色观察微循环损伤情况不同时间点处死动物后取出眼球，40 g·L-1FAP固定2 h。显微镜下去除角膜、虹膜、晶状体、玻璃体，将留下的视网膜朝视神经方向剪成4瓣，甲醇固定15 min后，使用体积分数20%胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)+5 g·L-1细胞裂解液(TritonX-100)+100×PBS进行封闭打孔1 h。同工凝集素(Isolectin B4)1200染色4 ℃过夜[8]。荧光显微镜下观察血管结构损伤情况，计算浅层及深层毛细血管密度[9]，进行统计分析。

1.4.3 视网膜铺片血管染色观察血管结构损伤与小胶质细胞的关系铺片并于荧光显微镜下观察、拍照。选择浅层及深层视网膜血管网，观察小胶质细胞活化与血管关系，并在40倍视野下计数3个随机区域的活化呈阿米巴样的小胶质细胞数，计算其平均值，进行统计分析[10-11]。

1.4.4 RT-PCR检测与微循环损伤相关的两类因子的表达情况检测与微循环损伤密切相关的两类因子包括：缺氧相关因子：血管内皮生长因子A(vascular endothelial growth factor-A，VEGF-A)、缺氧诱导因子-1α(hypoxia inducible factor-1α，HIF-1α)。炎症因子：肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)，白细胞介素1β(interleukin 1β，IL-1β)[12-13]。设计合成小鼠上述基因引物，各目的基因的引物序列为：VEGF-A：上游引物：5’-CAGAAGGAGAGCAGAAGTCC-3’，下游引物：5’-CTCCAGGGCTTCATCGTTA-3’；HIF-1α：上游引物：5’-CCAGCAGACTCAAATACAAGAACC-3’，下游引物：5’-TGTATGTGGGTAGGAGATGGAGAT-3’；TNF-α：上游引物：5’-AAATGGGCTTTCCGAATTCA-3’，下游引物：5’-CAGGGAAGAATCTGGAAAGGT-3’；IL-1β：上游引物：5’-TGAAATGCCACCTTTTGACAG-3’，下游引物：5’-CCACAGCCACAATGAGTGATAC-3’；β-Actin：上游引物：5’-GGCACCAGGGCGTGATGG-3’，下游引物：5’-GTCTCAAACATGATCTGGGTC-3’。摘除眼球，将视网膜神经上皮层在PBS液中漂洗，按RNA提取试剂盒说明书提取总RNA。逆转录生成模板cDNA：将乙醇保存的RNA离心，逆转录为c-DNA。RT-PCR反应，制定标准曲线和定量分析。

1.5 统计学方法采用SPSS 18.0统计学软件进行统计分析。数据资料经Shpiro-Wilk检验符合正态分布，数据以均数±标准差表示，各组间行单因素方差分析，行各组间两两比较，检验水准：α=0.05。

2 结果

2.1 RIRI后不同时间微循环结构损伤情况正常对照组小鼠视网膜血管染色清晰，自视盘发出后放射状分布于各象限，并逐渐分支至毛细血管，微血管走行规则，血管管径粗细一致(图1A)；RIRI后24 h组，大部分血管仍呈正常形态，但可观察到少量毛细血管开始闭塞呈线状(图1B)；RIRI后48 h组，闭塞的血管数量增多，整个血管网失去均匀的网状结构，大量血管管径变得粗细不均(图1C)；RIRI后72 h组，血管损伤明显加重，可见片状的无灌注区形成(图1D)。

视网膜浅层及深层毛细血管密度计算结果显示：浅层毛细血管密度正常对照组为(129.50±7.80)μm-1，RIRI后24 h、48 h、72 h组毛细血管密度分别为(125.50±5.59)μm-1、(126.30±4.69)μm-1、(122.30±6.78)μm-1。浅层毛细血管密度RIRI后24 h、48 h、72 h组间两两比较差异均无统计学意义(均为P>0.05)。RIRI后24 h组、48 h组、72 h 组深层血管网毛细血管密度分别为(312.10±11.93)μm-1、(312.50±7.51)μm-1、(298.40±9.21)μm-1。RIRI后24 h、48 h组与正常对照组(320.80±12.66)μm-1相比差异均无统计学意义(均为P>0.05)，RIRI后72 h组与其余3组相比毛细血管密度明显减少，差异均有统计学意义(均为P<0.05)。

2.2 视网膜冰冻切片免疫荧光染色观察小胶质细胞活化及迁移情况视网膜冰冻切片观察小胶质细胞的活化情况可见，与正常对照组小鼠(图2A)相比，RIRI后24 h组可见少许小胶质细胞出现在内丛状层(图2B)。RIRI后48 h组，内丛状层内见大量Iba-1阳性细胞，并开始向外丛状层移动，同时小胶质细胞的形态从分支状向阿米巴样改变(图2C)。这种形态、数量、向视网膜深层移动的特征在损伤后72 h达到高峰(图2D)。因此，损伤后小胶质细胞活化，并分布于视网膜内丛状层及外丛状层，这种分布与视网膜的血管分布层次相一致。Iba-1阳性细胞在各层次的分布数量分别为：正常对照组(神经节细胞层、内丛状层、内核层、外丛状层)分别为2.40±0.91、0.30±0.64、0、0；RIRI后24 h组依次为2.90±1.13、0.80±0.74、0、0；RIRI后48 h组依次为7.00±1.18、11.90±2.46、2.70±1.18、2.90±1.36；RIRI后72 h组依次为10.60±2.37、16.00±2.09、4.40±1.42、3.90±1.37；RIRI后24 h组与正常对照相比各层视网膜中Iba-1阳性细胞数差异均无统计学意义(均为P>0.05)；RIRI后48 h组视网膜各层中Iba-1阳性细胞数与正常对照组及24 h组差异均有统计学意义(均为P<0.05)；RIRI后72 h组视网膜各层中Iba-1阳性细胞数与正常对照组、RIRI后24 h组、RIRI后48 h组差异均有统计学意义(均为P<0.05)。

图1 各组动物视网膜铺片谷氨酰胺合成酶血管染色图。A：正常对照组小鼠视网膜血管走行规则，管径粗细一致；B：RIRI后24 h组部分毛细血管闭塞呈线状(箭头)；C：RIRI后48 h组血管网失去均匀的网状结构，管径粗细不均；D：RIRI后72 h组可见片状的无灌注区(箭头区)

2.3 RIRI后视网膜微循环损伤与小胶质细胞的关系浅层毛细血管网视网膜血管与小胶质细胞观察可见：正常对照组可见视网膜血管走行、管径正常，血管网间及各级血管附近未见Iba-1阳性细胞分布(图3A)。RIRI后24 h组可见少量小胶质细胞，但多呈分支状形态，尚未完全转化为活化状态(图3B)。RIRI后48 h组视网膜血管扩张明显，血管附近大量呈阿米巴样的小胶质细胞(图3C)。RIRI后72 h组大量小胶质细胞活化，外观呈阿米巴样甚至球形，并大量附着于血管表面(图3D)。正常对照组及RIRI后24 h组、48 h组、72 h组Iba-1阳性细胞数分别为：1.40±0.91、4.00±1.09、19.60±2.24、24.00±2.45。

深层视网膜血管网表现出与浅层同样的变化规律(图4)。正常对照组及RIRI后24 h组、48 h组、72 h组Iba-1阳性细胞数分别为：1.40±1.11、3.50±1.20、20.70±2.14、23.50±2.72。

图2 RIRI后不同时相小胶质细胞活化及分布图。A：RIRI后24 h组，可见视网膜内丛状层散在分布少量Iba-1阳性细胞；B：RIRI后48 h组，内丛状层中可见明显增多的Iba-1阳性细胞；C：RIRI后72 h组，Iba-1阳性细胞明显增多并向内核层及外丛状层迁移；D：正常对照组各层视网膜组织内未见Iba-1阳性细胞

图3 RIRI后不同时间视网膜浅层小胶质细胞与血管免疫荧光染色图。A：正常对照组可见视网膜血管走行、管径正常，血管附近未见Iba-1阳性细胞分布；B：RIRI后24 h组，可见少量小胶质细胞，但多呈分支状形态；C：RIRI后48 h组，视网膜血管扩张明显，血管附近大量呈阿米巴样的小胶质细胞；D：RIRI后72 h组，大量小胶质细胞活化，外观呈阿米巴样甚至球形，并大量附着于血管表面

图4 RIRI后不同时间视网膜深层小胶质细胞与血管免疫荧光染色图。A：正常对照组可见深层毛细血管网分布，血管附近未见Iba-1阳性细胞；B:RIRI后24 h组，可见毛细血管网附近少量小胶质细胞，但多呈分支状形态；C:RIRI后48 h组，毛细血管附近大量呈阿米巴样的小胶质细胞；D:RIRI后72 h组，大量小胶质细胞活化，外观呈阿米巴样甚至球形，并大量附着于血管表面

RIRI后24 h组与正常对照组Iba-1阳性细胞数在两个层次的视网膜毛细血管中差异均无统计学意义(均为P>0.05)。RIRI后48 h组和72 h组Iba-1阳性细胞数明显增加，相比于正常对照组和RIRI后24 h组在两个层次毛细血管中差异均有统计学意义(均为P<0.05)，而RIRI后72 h组小胶质细胞的活化达到高峰，与RIRI后48 h组比较差异有统计学意义(P<0.05)。

2.4 RT-PCR检测缺氧反应因子及相关炎症因子表达情况RT-PCR结果显示：正常对照组、RIRI后24 h组、RIRI后48 h组、RIRI后72 h组VEGF的相对表达量分别为：1.00±0.13、1.61±0.26、3.21±0.35、5.01±0.39。HIF-1α的相对表达量分别为：1.00±0.13、2.84±0.42、4.29±0.36、6.45±0.35。RT-PCR结果显示：正常对照组及RIRI后24 h组、RIRI后48 h组、RIRI后72 h组TNF-α的相对表达量分别为：1.00±0.13、2.46±0.37、4.00±0.36、4.17±0.36。各组IL-1β的相对表达量分别为：1.00±0.13、2.52±0.35、4.10±0.47、4.25±0.40。

VEGF、HIF-1α、TNF-α、IL-1β均表现出相对表达量的一致性，正常对照组及RIRI后24 h组、48 h组、72 h组，两两比较差异均有统计学意义(均为P<0.05)。

3 讨论

RIRI性疾病除了组织供血核心区域的细胞在急性缺血阶段出现大量坏死外，在损伤后期，由于微循环损伤造成的组织水肿，炎症反应上调等也是造成组织器官结构和功能障碍的主要原因。近年来，抗VEGF药物的研发和使用在一定程度上对IRI性疾病微循环损伤起到了一定的治疗作用，抗VEGF药物仅针对损伤后的微血管进行治疗，并存在治疗效果有限、药物作用周期短等问题[14-15]。因此，仍需进一步研究明确IRI性疾病中微循环损伤的机制及关键作用因子，寻找治疗的新思路及新靶点。

正常视网膜中小胶质细胞是一类处于静息状态的免疫活性细胞。当缺血损伤发生时，小胶质细胞由静息状态变为活化状态，活化的小胶质细胞发生形态和功能上的改变。一方面，细胞胞体膨大、突触缩短，类似阿米巴样改变，使其具有了吞噬细胞的功能；另一方面，活化的小胶质细胞可诱导大量炎症因子的表达上调，诱发过度的炎症反应，造成组织的进一步损伤。小胶质细胞在IRI损伤中的破坏作用已经有大量研究证实，但既往对其研究多集中在神经细胞损伤领域。近年来人们逐渐发现，活化的小胶质细胞在缺血-再灌注微循环损伤中对血管的损伤也发挥了一定作用。

目前普遍认为RIRI过程中小胶质细胞对微循环损伤的作用机制可能包括以下几个方面：活化的小胶质细胞具有明确的向血管迁移的特征。一项脑部缺血损伤的研究显示[2]，当RIRI发生后，大量小胶质细胞激活，这些激活的小胶质细胞除了集中在神经元附近，同样密集分布在血管周围。动态观察显示，这种血管周围活化小胶质细胞数在损伤后24～72 h增加了3倍左右；同时3D重建结果显示，大量活化的小胶质细胞移动至血管表面并将其包绕覆盖。我们在冰冻切片的观察结果也证实了损伤发生后，小胶质细胞除了在内丛状层这一浅层血管层次大量分布外，还向深层的毛细血管层迁移。视网膜铺片的结果也显示活化的小胶质细胞迁移至血管附近，并附着于血管表面。这些结果都提示了活化小胶质细胞对循环损伤的初步证据。

此外，有研究结果显示IRI发生后，在活化的小胶质细胞内部发现了多种特异性抗体所标记的血管内皮细胞，证实了活化小胶质细胞对内皮细胞发生了物理性的吞噬作用，这种吞噬作用在IRI后8 h开始发生、24 h明显增加、72 h达到顶峰[3]。对血管的吞噬作用最终造成血管结构的崩解，引发更为严重的缺血性损伤。有研究发现发生RIRI后24 h，小胶质细胞开始对血管产生损伤作用，这些血管通透性明显增强，血浆成分(主要为血浆白蛋白和纤维蛋白原)发生渗漏。这些渗漏进入组织的血浆成分又诱发了新的小胶质细胞活化、迁移，诱发新一轮的炎症上调及吞噬作用，造成血管损伤的恶性循环[16-17]。我们对损伤后视网膜组织VEGF及HIF-1α这两个因子的检测结果显示，在血流已恢复、缺血缺氧缓解后，二者仍呈现高表达的态势，证明了组织的缺氧损伤持续存在，这种存在是血管损伤后供血障碍所继发的，并与小胶质细胞的活化表达呈一致性[18-19]。

另一方面，除了上述的物理性破坏作用，小胶质细胞还发挥着炎症因子的重要调控作用。活化的小胶质细胞诱发大量炎症因子的表达，诱发过度的炎症反应破坏血-视网膜屏障[20]。多种与血-脑屏障相关的标记物在IRI后明显上调，并与小胶质细胞的激活呈相关性，我们对相关炎症因子的检测结果也得到了同样的结论，多种炎症因子与缺氧反应因子呈同样的表达趋势，在再灌注实现血供恢复的后期，各类炎症因子仍高表达，与小胶质细胞的活化呈一致性。这些炎症因子是造成血管屏障功能损伤的一大途径。因此，小胶质细胞活化所诱发的炎症反应也是造成微循环破坏的另一重要因素。

综上所述，小胶质细胞的活化是RIRI性疾病中导致微血管破坏的重要因素，抑制RIRI后小胶质细胞的活性，可以抑制小胶质细胞对血管的物理及化学性损伤，可稳定血管结构、提升血流量，减少微循环的损伤，从而达到保护靶组织的目的。