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巩膜上静脉烙闭法建立大鼠高眼压模型对视网膜微观结构的影响△

2019-07-08韩双羽赵靖康刘慧峰任媛蒋琳燕王霞刘旭何媛

眼科新进展 2019年7期
关键词:巩膜眼压青光眼

韩双羽 赵靖康 刘慧峰 任媛 蒋琳燕 王霞 刘旭 何媛

青光眼是一种慢性、进行性和不可逆性视神经病变,以视网膜神经节细胞(retinal ganglion cells,RGCs)的进行性死亡和轴突丢失为特征,表现为视网膜神经纤维层变薄和视盘凹陷导致的视神经损害及视野缺损。2010年,全世界青光眼患者超过6000万[1],预计到2040年,全世界青光眼患者将超过1.1亿,青光眼将成为世界范围内影响人类健康的疾病之一[2]。高眼压是青光眼视神经损害发生和发展机制中最重要的危险因素之一[5]。目前,青光眼唯一有效的治疗方法就是降低眼压[3-4]。因此,建立高眼压动物模型对于我们明确青光眼发病机制、寻找新的治疗方法预防致盲都是极其重要的[6]。

理想的动物模型应该易于建立、可重复且廉价,最重要的是尽可能与人类青光眼相似。有报道称,通过烙闭大鼠巩膜上静脉能够建立眼压中度增高、持续时间较长的大鼠高眼压模型[7]。该方法烙闭大鼠巩膜上静脉,操作无需进入眼内,发生眼内感染风险小,对大鼠眼内结构无影响,且易于操作、可重复性高,虽然目前已有相关研究提示此方法能升高大鼠眼压,但这类型研究实验结果尚不稳定,且本研究运用体内外实验观察视网膜结构,包括光学相干断层扫描(optical coherence tomography,OCT)仪在活体状态下测量视网膜厚度,含视网膜全层厚度和神经纤维层(nerve fiber layer,NFL)、神经节细胞层(ganglion cell layer,GCL)、内丛状层(inner plexiform layer,IPL)的总厚度,这是过去方法没有涉及的;还包括制作苏木精-伊红(hematoxylin eosin,HE)染色切片测量视网膜各层厚度及计数RGCs。本研究期望通过烙闭大鼠巩膜上静脉得到高眼压模型,为青光眼视神经损伤及保护机制提供研究基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物及分组随机选取不同体质量SD大鼠(雌雄随机,西安交通大学实验动物中心提供)40只,按体质量分为A组(150~200 g)、B组(>200~250 g)、C组(>250~300 g)、D组(>300~350 g),每组各10只。随机选取体质量250~300 g的SD大鼠(雌雄随机,西安交通大学实验动物中心提供)40只造模,右眼制造青光眼模型定为实验眼,左眼不作处理定为对照眼。纳入标准:(1)无外眼部疾病;(2)双眼瞳孔直接对光反射和间接对光反射正常。连续测量3 d眼压,剔除平均眼压高于或低于正常眼压区间者。

1.1.2 试剂与仪器水合氯醛(上海国药集团化学试剂有限公司);盐酸丙美卡因滴眼液(美国爱尔康公司);妥布霉素地塞米松眼膏(美国爱尔康公司);左氧氟沙星滴眼液(日本参天公司);40 g·L-1多聚甲醛固定液(西安依科生物技术有限公司);不可吸收缝合线(强生上海医疗器材有限公司);回弹式眼压计(天津索维电子技术有限公司);Cirrus HD-OCT(德国蔡司公司);光学显微镜(德国Leica公司)。

1.2 方法

1.2.1 造模方法使用100 g·L-1水合氯醛按3.5~4.0 mL·kg-1体质量进行左下腹腹腔注射全身麻醉,给予实验眼盐酸丙美卡因滴眼液表面麻醉,撑开眼睑,沿上方角巩膜缘剪开球结膜,钝性分离筋膜,暴露巩膜上静脉,烙闭大鼠上直肌旁两条、颞侧一条巩膜上静脉,若能发现明确的下方巩膜上静脉,一并烙闭之。烙闭成功的标志:近角巩膜缘段血管怒张,远角巩膜缘段血流消失,无出血。术毕,以10-0不可吸收缝合线间断缝合结膜,缝合后给予妥布霉素地塞米松眼膏,待大鼠苏醒后放回笼内。术后以左氧氟沙星滴眼液滴眼,每天2次,连续7 d。左眼作为对照眼不作处理。

1.2.2 眼压测量大鼠清醒状态下,用回弹式眼压计测量眼压,测量3次取平均值。A、B、C、D组大鼠分别于早1000和晚1000测量白天和夜间眼压。造模大鼠于术前3 d测量基线眼压,造模术后即刻、1~7 d、14 d、21 d、28 d分别测量眼压,并观察实验眼的局部表现。

1.2.3 视网膜厚度测量于术前及术后28 d,大鼠全身麻醉状态下,用Cirrus HD-OCT测量视网膜厚度,其中以距大鼠视神经2000 μm处的全层视网膜厚度及内三层,包括NFL、GCL和IPL的总厚度为待测厚度。

1.2.4 观察视网膜结构于术后28 d过量麻醉处死大鼠,摘除眼球固定于40 g·L-1多聚甲醛固定液中,24 h后行石蜡包埋切片,切片方向与眼轴平行,切片取经视神经处,厚度为4 μm,连续3张切片,并行HE染色。在光学显微镜下观察视网膜形态结构,并运用图像处理软件测量距离视神经2 mm处的视网膜各层厚度,其中以NFL和GCL(内层),IPL和内核层(inner nuclear layer,INL)(中层),外丛状层(outer plexiform layer,OPL)和外核层(outer nuclear layer,ONL)(外层),及NFL、GCL、IPL内三层总厚度为待测厚度,计数距视神经2 mm处的20倍物镜下一个视野(长度约600 μm)视网膜的 RGCs个数,以及计数一张切片下一圈(长度约10 mm)视网膜的RGCs个数。同一切片测量、计数3次,取平均值。

2 结果

2.1 眼压情况

2.1.1 不同体质量大鼠基线眼压A组白天眼压或夜间眼压均较B、C、D组低,差异均有统计学意义(均为P<0.05),B组、C组、D组之间白天眼压或夜间眼压差异均无统计学意义(均为P>0.05),A、B、C、D组组内夜间眼压均较白天高,差异均有统计学意义(均为P=0.000)。见表1。

表1 不同体质量大鼠基线眼压

组别白天眼压/mmHg夜间眼压/mmHgt值P值A组8.73±1.4810.37±1.404.2100.000B组9.93±1.20∗11.83±0.75∗5.1610.000C组10.00±1.31∗11.56±0.94∗5.8940.000D组10.00±1.49∗10.48±1.55∗4.6360.000F值6.14712.043--P值0.0010.000--

注:与A组相比,*P<0.05。1 kPa=7.5 mmHg

2.1.2 造模大鼠基线眼压大鼠白天眼压为7~12(9.85±1.39)mmHg,夜间眼压为8~13(11.31±1.10)mmHg,大鼠夜间眼压比白天眼压高(1.46±1.73)mmHg,差异具有统计学意义(t=13.039,P<0.001)。术前白天眼压实验眼为(9.78±1.42)mmHg,对照眼为(9.93±1.36)mmHg,差异无统计学意义(t=0.827,P>0.05)。

2.1.3 造模大鼠术后眼压对比实验眼眼压于术后即刻达到峰值(22.80±4.74)mmHg,较对照眼高约122%,差异具有统计学意义(t=14.018,P<0.001),之后眼压缓慢下降,术后1~7 d实验眼眼压均较对照眼高(均为P<0.001),术后第7天实验眼眼压较对照眼高约59%(t=9.524,P<0.001),术后14 d实验眼眼压较对照眼高约41%(t=12.571,P<0.001),术后21 d实验眼眼压较对照眼高20%(t=5.426,P<0.001),至术后28 d实验眼眼压与对照眼对比差异无统计学意义(t=1.682,P>0.05)。

2.2 OCT测量视网膜厚度实验眼术后视网膜内三层厚度较术前薄(P<0.01),术后实验眼视网膜内三层厚度较对照眼薄(P<0.05)。而全层视网膜厚度变化差异无统计学意义(P>0.05)。见表2和图1。

2.3 HE染色切片观察视网膜结构计数20倍物镜下一个视野(长度约600 μm)视网膜以及计数一张切片下一圈(长度约10 mm)视网膜的RGCs数量均显示实验眼较对照眼减少(均为P<0.001)。见表3。正常视网膜结构层次清晰,各层细胞排列紧密,大小均一,视网膜较厚(图2A)。实验眼内、中、外层视网膜均较对照眼薄(均为P<0.05;图2B),其中以内层视网膜变化最明显,减少率达24.75%。

表2 OCT测量视网膜内三层及全层厚度情况

组别内三层厚度/μm全层厚度/μm术前实验眼88.72±6.05208.60±8.18对照眼86.80±7.29210.64±9.74术后实验眼81.40±6.61∗205.00±8.63对照眼88.48±5.86#206.12±9.55F值6.9251.954P值0.0000.126

注:与术前实验眼相比,*P<0.01;与术后实验眼相比,#P<0.05

图1 大鼠视网膜情况。A:正常大鼠OCT;B:术前实验眼OCT;C:术后实验眼OCT

表3 HE切片观测视网膜各参数变化

组别视网膜厚度/μm内层中层外层内三层RGCs数量/10 mmRGCs数量/600 μm对照眼40.80±11.2697.79±15.9571.93±11.46103.94±17.55(442.40±82.62)个(34.59±6.32)个实验眼30.70±8.7088.28±17.8867.99±10.2091.74±17.44(321.86±64.55)个(26.59±6.48)个F值34.60810.7834.50816.64918.97525.827P值0.0000.0010.0360.0000.0000.000减少率24.75%9.72%5.48%11.74%27.25%23.02%

注:减少率=(1-对照组均值/实验组均值)×100%;内层:NFL+GCL;中层:IPL+INL;外层:OPL+ONL;内三层:NFL+GCL+IPL

图2 HE染色切片观察视网膜结构(×400)。A:对照眼;B:实验眼。IS/OS:光感受器内外节,RPE:视网膜色素上皮层

2.4 其他眼部情况40只SD大鼠中4只术后出现角膜溃疡,眼压高达40 mmHg,其中3只角膜穿孔,眼球破裂,眼压最高达68 mmHg;1只角膜溃疡愈合,形成角膜白斑。少数高眼压大鼠出现角膜水肿。

3 讨论

青光眼是最常见的致盲性眼病之一,人类青光眼的发生发展中最重要的可调节危险因素是眼压,降眼压治疗不仅可以降低高眼压症患者转变为青光眼的风险,同时可以阻止青光眼疾病的进展[8]。动物高眼压模型是研究青光眼的基础,从1870年以来,人们就开始尝试用不同的方法诱导建立动物高眼压模型,包括高渗盐水巩膜上静脉注射模型,激光诱导高眼压模型,微球注射模型和自发或遗传操作的突变型青光眼模型等[9-13],这些方法有的价格昂贵,有的操作复杂。本实验选取巩膜上静脉烙闭法建立高眼压模型,该方法操作简单、廉价且可重复性高。正常情况下,房水从前房的小梁网进入Schlemm管,再由集合管或房水静脉汇入巩膜上静脉(常规途径)或由葡萄膜巩膜途径流出眼外,而巩膜上静脉引流的房水占房水流出总量的85%~95%。各种因素导致的巩膜上静脉压升高,均可引起眼压增高。巩膜上静脉烙闭法就是据此原理形成的方法。本实验选取大鼠是由于啮齿类动物易于获取,且具有与人眼相似的房水外流结构,唯一不足的可能是大鼠是胶质筛板,而非纤维筛板,Kim等[14]研究认为,灵长动物的RGCs损伤是由于轴突与筛板的相互作用引起的。

本研究将不同体质量大鼠分组进行基线眼压测量,发现当体质量大于200 g后,眼压不随体质量增加而改变。许天新等[15]报道,雄性SD大鼠约达7周龄体质量超过200 g,雌鼠约达8周龄体质量超过200 g,均达到性成熟期。本研究预实验阶段,曾行不同体质量大鼠灼烙术,发现150~250 g大鼠巩膜壁极薄,能透现脉络膜颜色,灼烙时极易使巩膜穿孔,而体质量大于250 g的大鼠明显比体质量小的大鼠的巩膜更致密,不易烙穿。故综合考虑眼压及巩膜情况,最终选择体质量为250~300 g的大鼠。

本方法可维持眼压升长达3周,造模成功率达75%。术后眼压即刻升高达峰值之后缓慢下降这一特征与Bai等[7]报道的结果一致,但维持时间较其短。为探究原因,我们于术后3周将部分大鼠再次麻醉,打开球结膜发现部分烙闭后的静脉形成侧支循环而再通。根据Bang等[16]的研究,当急性升高的眼压恢复正常后,视功能可恢复,但大约10 mmHg的急性眼压升高可产生永久性视功能障碍,当大鼠眼压达60 mmHg,并持续约105 min,则可以产生永久性视功能丧失。而本实验引起了3周眼压升高,且术后即刻眼压升高大于10 mmHg,根据Bang等[16]的报道,本研究中大鼠视功能也受到了损害,而这一特征在视网膜厚度及RGCs计数结果中得到了验证。

Matlach等[17]研究表明,Cirrus HD-OCT在测量视盘旁视神经纤维层和黄斑视神经纤维层-RGC层-IPL厚度可重复性高,而且确定视盘旁视神经纤维层和黄斑视神经纤维层-RGC层-IPL厚度是青光眼患者RGCs损伤的最敏感参数。本研究选用Cirrus HD-OCT测量视网膜全层厚度及内三层(NFL、GCL、IPL)厚度,结果显示,术后视网膜内三层厚度较术前变薄,而视网膜总厚度无显著改变,内三层对应着RGCs的轴突、细胞体,借此验证了RGCs对高眼压更敏感,也验证了Matlach等[17]对于内层视网膜对眼压更敏感这一结论。

庞国龙等[18]研究表明,大鼠高眼压第1周、第2周RGCs数量减少,RGC层、NFL、IPL、OPL、INL、ONL水肿,到高眼压第3周RGCs明显萎缩、视网膜各层变薄,尤其是NFL。本研究结果显示,高眼压引起了内层视网膜变薄,即RGCs及其轴突受损,还引起了IPL、OPL、INL、ONL的变薄,由内到外减少率依次增加,说明损伤是由内向外蔓延的,易损性由内向外依次降低,这一特征与庞国龙等[18]的研究相符,皆为内层视网膜最易受到高眼压的影响。而进一步研究有待更精细的形态学观察。

综上所述,本实验证明巩膜上静脉烙闭法可引起SD大鼠3周的眼压升高,且使RGCs数量减少、视网膜变薄,尤其是内层视网膜。本方法具有操作简单,重复性好,成模率高,升高的眼压可稳定维持一定时间等优点,是较为理想的大鼠高眼压模型制备方法,值得进一步完善及应用。

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