王雪华，赵海平，孙伟丽，姚梦杰，李春义*，李海涛*

1.南京中医药大学 药学院，江苏 南京 210023；2.中国农业科学院 特产研究所，吉林 长春 130112

骨质疏松症(osteoporosis，OP)是一种以全身骨量减少、骨密度损失及骨组织微观结构退化为特征，并引起骨强度降低、骨脆性增加、骨折危险性增大的全身代谢性疾病[1]。临床以周身疼痛、身高降低、驼背、脆性骨折及呼吸系统受影响等为主要表现[2]。原发性骨质疏松症属于高转换型骨质疏松症，常发于老年人及绝经后妇女[3]。中医理论中依据其临床症状及病因病机，多将其归属为“骨痿”的范畴，临床普遍认同肾虚是主要病机，肝脾不足、血瘀痰浊等也与之密切相关[4]。由于原发性骨质疏松症属于发病率高的慢性疾病，所以保健费用消耗比较大，并且严重影响老年人的健康和生活质量，已经成为一个世界范围的健康问题。

鹿茸为鹿科动物马鹿CervuselaphusLinnaeus和梅花鹿CervusnipponTemminck的雄鹿头上未骨化密生茸毛的幼角，始载于汉代的《神农本草经》，具有壮肾阳、益精血、调充任的功效，用于肾阳不足、经血亏虚、阳痿滑精、宫冷不孕、眩晕耳鸣、耳聋等[5]。据我国古籍记载：“壮骨”为鹿茸的最主要功效[6]。中医临床研究显示，作为补肾中药的鹿茸可以促进骨形成和骨量增加，提升骨密度，从而达到治疗骨质疏松的目的[7-8]。鹿血有养血益精、活血祛瘀的功效[9]和治疗骨质疏松的作用，据研究，鹿血可以增加去卵巢骨质疏松型大鼠的椎骨与股骨的强度，修复破坏的骨小梁。煅牡蛎由牡蛎加工炮制而成，两者均有抗骨质疏松的效果[10-11]。

本研究取鹿茸上段为君药，鹿血为臣，牡蛎为佐，在复方组成上不同于以往的研究。对3月龄Wistar雌性大鼠切除卵巢可以手术构建绝经后骨质疏松模型动物，给药12周后，通过检测大鼠体质量、子宫质量、血清指标、骨质量、骨钙含量、骨磷含量、骨组织染色和骨小梁面积等指标评估鹿茸复方对大鼠骨质疏松模型的防治作用，为中药复方治疗骨质疏松的研究提供理论参考。

1 材料

1.1 动物

SPF级Wistar雌性大鼠，3月龄未经产，32只，体质量为(260±20)g，购于辽宁长生生物技术有限公司，许可证号为SCXK(辽)2015-0001，饲养温度为(22±3)℃，湿度50%～75%，自然光源，标准营养颗粒饲料喂养(购自辽宁长生生物技术有限公司)，自由饮水，适应性饲养一周后用于实验。

1.2 药材

鹿茸为采集新鲜梅花鹿茸，按照NY/T 1162-2006中描述的方法，将鹿茸的蜡片和粉片取出作为上段，处理后粉碎。鹿血为采集梅花鹿新鲜血液，按照DB21/T 1465-2006描述的方法，将鹿血制成粉末。煅牡蛎购于康美药业有限公司(批号：170901611)。鹿茸经中国农业科学院特产研究所孙红梅博士鉴定为梅花鹿C.Temminck三杈茸；鹿血为梅花鹿C.Temminck膛血；煅牡蛎购于康美药业有限公司(批号：170901611)，为牡蛎科动物大连湾牡蛎Ostreatalienwhanensis。

1.3 试剂与器材

1.3.1 试剂 青霉素注射液、链霉素注射液(哈药集团兽药有限公司)，4%多聚甲醛、10%水合氯醛(诺和诺德公司)，羧甲基纤维素钠(CMC-Na)，β-雌二醇，EDTA，钒钼酸，EDTA-Na2(长春华益生物科技有限公司)，乙醇(国药集团化学试剂有限公司)，二甲苯(北京化工厂)，苏木精染液、伊红染液(天津市光复精细化工研究所)，碱性磷酸酶(ALP)、骨钙素(BGP)、甲状旁腺激素(PTH)、降钙素(CT)的ELISA试剂盒(上海酶联生物科技有限公司)，硝酸、浓盐酸、浓硫酸(国药集团)，钙离子标准溶液、磷离子标准溶液(国家有色金属及电子材料分析测试中心)。

1.3.2 仪器 BFM-6BI型贝利微粉机(济南倍力粉技术工程有限公司)，BSA224S型电子天平(赛多利斯科学仪器有限公司)，SCMF-3000自动灰(挥发)分仪(长春实诚科技有限公司)，BSA8201型电子天平(赛多利斯科学仪器有限公司)，SDW-1型微机控制三点弯曲试验机(济南时代新光仪器有限公司)，火焰光度计6400A(上海傲谱分析仪器有限公司)，5810R型离心机(凯特实验仪器有限公司)，2255型LEICA切片机(德国徕卡公司)，1150 H型LEICA包埋机(德国徕卡公司)，90i正置荧光显微镜(尼康公司)。

2 方法

2.1 动物模型建立

用10%水合氯醛腹腔注射麻醉(3 mL·kg-1)，麻醉后仰卧固定，于最末肋骨下，距脊椎柱外侧约2 cm处去毛，先后用碘伏和75%乙醇消毒，纵行切开皮肤约2 cm，剥离肌肉组织，结扎两侧输卵管，摘除两侧卵巢，将子宫角送回腹腔中，注入双抗(40万U·kg-1)，缝合切口，75%乙醇擦拭消毒。再取同批次大鼠8只，将大鼠用10%水合氯醛麻醉，麻醉后仰卧固定，在最末肋骨下，距脊椎柱外侧约2 cm处去毛消毒，纵行切开皮肤约2 cm后缝合，75%乙醇擦拭消毒。

2.2 分组与给药

将去卵巢大鼠随机分为3组，分别为模型组(OVX)，雌激素组(E2)，复方组(F)；没去卵巢的为对照组(Sham)，每组8只。根据《药理实验方法学》中“人和动物按体表面积折算的等效剂量比值表”进行给药剂量计算，Wistar大鼠给药剂量为人的6.3倍。鹿茸根据《中华人民共和国药典》给人的剂量为每天2 g·(60kg)-1，给大鼠的剂量为每天0.21 g·kg-1，复方(鹿茸-鹿血-牡蛎比例为4∶1∶1)给药总量为每天0.315 g·kg-1。

Sham组：CMC-Na与蒸馏水配制成质量分数为0.5%，以1 mL·d-1的剂量给大鼠灌胃，给药12周。

OVX组：CMC-Na与蒸馏水配制成质量分数为0.5%，以1 mL·d-1的剂量给大鼠灌胃，给药12周。

E2组：β-雌二醇以0.5% CMC-Na作为溶剂制成混悬液，以每天2.5 μg·kg-1的剂量给大鼠灌胃，给药12周。

F组：鹿茸复方以0.5% CMC-Na作为溶剂制成混悬液，以每天0.315 g·kg-1的剂量给大鼠灌胃，给药12周。

2.3 大鼠各生理样本的收集与处理

2.3.1 血液 将大鼠麻醉后固定，心脏取血。将全血分别转移至带标记离心管中，4 ℃静置30 min后，以4000 r·min-1，4 ℃离心15 min，移液器吸取上层血清分装于1.5 mL离心管，放入-80 ℃中，避免反复冻融。用ELISA试剂盒检测血清ALP、BGP、PTH和CT水平，原子吸收法测定血清Ca和血清P的含量，委托上海双赢生物科技有限公司检测。

2.3.2 子宫与骨骼 大鼠经心脏抽血至死亡后，仰卧固定，纵行切开腹部皮肤取出两侧子宫放入PBS中清洗至无血，滤纸吸干水分，称质量。沿着大鼠关节解剖取下其左侧和右侧股骨剔净附着的肌肉及结缔组织，左侧股骨65 ℃恒温箱中烘干备用，右侧股骨置于4%的多聚甲醛中固定、备用。

2.3.3骨钙和骨磷检测 取左侧股骨，65 ℃恒温箱中烘干，称质量，分装于坩埚中，碳化至不冒黑烟为止，550 ℃马弗炉高温灰化4 h，灰化后取出，干燥器中冷却至室温后称质量，计算灰分。每个样品加入10 mL盐酸(6 mol·L-1)加热溶解样品，转移至100 mL容量瓶中，蒸馏水定容至刻度。取2 mL样品溶液至三角瓶中，依次加入蒸馏水50 mL、淀粉10 mL(1 g·L-1)、三乙醇胺2 mL、乙二胺1 mL混匀后，加入孔雀绿一滴，盐酸羟胺少许，混匀后，加入氢氧化钾10 mL(200 g·L-1)，混匀后加少许钙黄素指示剂，混匀后待测样品呈绿色，进行EDTA滴定，读取刻度后计算骨钙浓度。从100 mL容量瓶取1 mL样品至50 mL容量瓶中，加入10 mL钒钼酸铵，混匀20 min后蒸馏水定容至刻度，混匀，每个样取300 μL至96孔板中，全自动酶标仪450 nm的波长下检测吸光值，计算骨磷的浓度。

2.3.4 HE染色 取小鼠右侧股骨组织，经4%多聚甲醛固定，EDTA-Na2溶液脱钙21 d，取股骨远端1/3处干骺端纵切，自来水水洗过夜，乙醇逐级脱水，二甲苯透明，石蜡包埋，切片厚度为5 μm，于64 ℃恒温烘箱烤片3 h左右，苏木精-伊红染液染色，透明2次后中性树胶封片。光学显微镜下(4×10)观察各组小鼠股骨组织片HE染色情况，并用Image Pro Plus 6.0软件手动对大鼠股骨组织切片面积进行计算，每组选取4张切片，每张切片40倍视野下随机选取2个视野，每组共8个视野，计算40倍视野下骨小梁面积所占总面积比值。

2.4 数据处理

3 结果

3.1 体质量

与Sham组比较，OVX组大鼠的体质量增长率明显升高(P<0.01)；与OVX组比较，E2组大鼠体质量增长率无明显变化，F组大鼠体质量增长率明显降低(P<0.05)；与E2组比较，F组大鼠体质量增长率无明显变化，见表1。

表1 各组大鼠实验前后体质量变化

注：与Sham组比较，**P<0.001；与OVX组比较，#P<0.05。

3.2 大鼠子宫质量与脏器指数

与Sham组比较，OVX组大鼠的子宫质量明显降低(P<0.001)；与OVX组比较，E2组大鼠子宫质量明显升高(P<0.001)，而F组大鼠子宫质量没有明显变化；与E2组比较，F组大鼠子宫质量明显降低(P<0.001)，子宫脏器指数同子宫质量，见表2。

表2 各组大鼠子宫脏器指数

注：与Sham组比较，***P<0.001；与OVX组比较，###P<0.001；与E2组比较，△△△P<0.001。

3.3 血清指标

3.3.1 血清ALP和BGP含量 与Sham组比较，OVX组大鼠的血清ALP含量明显升高(P<0.01)；与OVX组比较，E2组和F组大鼠血清ALP含量没有明显变化；与E2组比较，F组大鼠血清ALP含量没有明显变化。与Sham组比较，OVX组大鼠的血清BGP含量明显升高(P<0.001)；与OVX组比较，E2组和F组大鼠血清BGP含量均明显降低(P<0.001)；与E2组比较，F组大鼠血清BGP含量没有明显变化，见表3。

表3 各组大鼠血清ALP和BGP指标 ng·mL-1

注：与Sham组比较，**P<0.01，***P<0.001；与OVX组比较，###P<0.001。

3.3.2 血清PTH和CT含量 与Sham组比较，OVX组大鼠的血清PTH含量明显升高(P<0.001)；与OVX组比较，E2组(P<0.05)和F组(P<0.01)大鼠血清PTH含量均显著降低；与E2组比较，F组大鼠血清PTH含量无明显变化。与Sham组比较，OVX组大鼠的血清CT显著降低(P<0.01)；与OVX组比较，E2组和F组大鼠的血清CT含量均无明显变化；与E2组比较，F组大鼠血清CT含量无明显变化，见表4。

表4 各组大鼠血清PTH和CT指标 ng·mL-1

注：与Sham组比较，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001；与OVX组比较，#P<0.05，##P<0.01。

3.3.3 血清Ca和P含量 与Sham组比较，OVX组大鼠血清Ca含量明显降低(P<0.05)；与OVX组比较，E2组和F组大鼠血清Ca含量没有明显变化；与E2组比较，F组大鼠血清Ca含量没有明显变化。与Sham组比较，OVX组大鼠血清P含量显著升高(P<0.05)；与OVX组比较，E2组(P<0.05)和F组(P<0.01)大鼠血清PTH含量均显著降低；与E2组比较，F组大鼠血清P含量没有明显变化，见表5。

表5 各组大鼠血清Ca和P指标 mg·mL-1

注：与Sham组比较，*P<0.05；与OVX组比较，#P<0.05，##P<0.01。

3.4 大鼠股骨质量与骨矿含量

与Sham组比较，OVX组大鼠股骨湿质量明显降低(P<0.01)；与OVX组比较，E2组和F组大鼠股骨湿质量没有明显变化；与E2组比较，F组大鼠股骨湿质量无明显变化。与Sham组比较，OVX组大鼠股骨干质量明显降低(P<0.01)；与OVX组比较，E2组和F组大鼠股骨干质量没有明显变化；与E2组比较，F组大鼠股骨干质量无明显变化。与Sham组比较，OVX组大鼠股骨灰分含量明显降低(P<0.01)；与OVX组比较，E2组大鼠股骨灰分含量没有明显变化，F组大鼠股骨灰分含量显著升高(P<0.05)；与E2组比较，F组大鼠股骨灰分含量无明显变化。与Sham组比较，OVX组大鼠股骨骨钙含量明显降低(P<0.001)；与OVX组比较，E2组(P<0.05)和F组(P<0.001)大鼠股骨骨钙含量均显著升高；与E2组比较，F组大鼠股骨骨钙含量无明显变化。与Sham组比较，OVX组大鼠股骨骨磷含量明显降低(P<0.001)；与OVX组比较，E2组(P<0.001)和F组(P<0.001)大鼠股骨骨磷含量均明显升高；与E2组比较，F组大鼠股骨骨磷含量无明显变化，见表6。

3.5 骨组织形态学检测和骨小梁面积比值

与Sham组比较，OVX组大鼠骨小梁数目减少，间隙变大，骨小梁断裂不相连接，结构不完整，呈典型的骨质疏松样，并且骨小梁面积显著降低(P<0.001)；与OVX组比较，E2组大鼠骨小梁数目较多，排列较紧密，连接成网状，并且骨小梁面积显著升高(P<0.001)；F组大鼠骨小梁排列较紧密，连接程度较高，骨小梁面积显著升高(P<0.001)；与E2组比较，F组骨小梁间隙、结构和面积均无明显变化，见图1和图2。

4 讨论

雌激素在机体内参与骨代谢，有促进前体细胞向成骨细胞分化并减少脂肪细胞的生成，促进骨形成、抑制骨吸收等作用[12-13]，雌激素匮乏会导致机体骨代谢异常，骨转换率升高、骨形成减弱、骨吸收增强、骨质流失致使骨质发生疏松[14]。ALP和BGP在矿化过程中起着重要作用，是骨转换率的重要指标[15-17]。PTH对骨代谢有双向调节作用，高剂量有促进骨吸收、低剂量有促进骨形成的作用[18-19]，CT的主要作用是抑制骨吸收[20]。血清PTH和CT含量还与机体内雌激素、血Ca和血P含量相关，雌激素缺乏、血清Ca含量降低、血清P含量升高时均会导致PTH分泌量增加、CT分泌下降[21]。本实验采用去卵巢致大鼠骨质疏松模型，可以在骨代谢方面较好地模拟人类绝经后骨质疏松症状[22]。实验结果显示，与Sham组比较，OVX组大鼠在去除卵巢后，子宫质量明显降低，体质量增长率增加，血清ALP、BGP和PTH含量均显著升高，但是血清CT、骨质量、骨钙含量、骨磷含量和骨小梁完整性均显著降低，说明大鼠切除卵巢后，雌激素分泌减少导致子宫萎缩，前体细胞向成骨细胞分化减少，同时血清Ca含量降低、血清P含量升高，三者同时导致PTH分泌增加、CT分泌减少，从而促进骨吸收，抑制骨形成，使大鼠骨钙和骨磷含量降低，骨矿物质流失显著升高，骨小梁完整性遭到破坏，骨质发生了疏松，造模成功。经过雌激素和鹿茸复方治疗之后，大鼠体质量增长率、骨转换率显著降低，血清PTH含量降低和CT含量升高，骨质量、骨钙和骨磷含量和骨小梁完整性均有所升高，说明鹿茸复方和雌激素均可以减缓因雌激素缺乏导致的骨质疏松，并且两组间差异无统计学意义。与雌激素不同，鹿茸复方对大鼠子宫萎缩没有明显的抑制作用，但是雌性激素在治疗绝经期后骨质疏松方面副作用较大，长期服用会有引发乳房肿痛、阴道出血、促凝血倾向及可能增加乳腺癌发生率的风险[23]。鉴于本研究结果，我们推测，临床上通过鹿茸组方来部分或者全部代替雌性激素，有可能在保证良好治疗效果的同时，在一定程度上降低治疗的不良反应。

表6 各组大鼠股骨湿质量、干质量、灰分、骨钙和骨磷指标

注：与Sham组比较，*P<0.05，**P<0.001，***P<0.001；与OVX组比较，#P<0.05，###P<0.001。

注：A.假手术组；B.模型组；C.雌激素组；D.复方组。图1 大鼠股骨组织切片(HE染色，40×)

注：与Sham组比较，**P<0.01，***P<0.001；与OVX组比较，###P<0.001。图2 各组大鼠股骨小梁面积比值