超分辨质谱分析浓香型白酒洋河梦之蓝（手工班）生物活性物质的研究

2019-07-03郭律均闫建斌

酿酒科技 2019年6期

杜然，郭律均，闫建斌

（清华大学生命科学学院，生物信息学教育部重点实验室，合成与系统生物学研究中心，北京100084）

白酒是中华民族文明的结晶，也是我国传统文化的重要组成部分[1]。它与白兰地、威士忌、朗姆酒、伏特加和金酒并称为世界六大蒸馏酒[2]。由于中国白酒采用特有的窖池固态发酵和固态蒸馏等工艺，使白酒不同于世界上其他蒸馏酒，含有极为丰富的微量成分，包括多种对健康有益的生物活性分子，如已报道的愈创木酚[3]、四甲基吡嗪[4]、γ-氨基丁酸[5]等。

洋河梦之蓝(手工班)是洋河集团近年来推出的新酒品。其基酒来自明清老窖池，而且采用了低温入池、低温发酵和低温馏酒的“三低”生产工艺。这些条件利于微生物生长代谢，可产生更多的生物活性物质。本研究综合采用气相质谱和超分辨质谱等精密检测技术，对其中的生物活性物质进行了分析，发现洋河梦之蓝(手工班)中除了含有白酒中常见的生物活性成分，还含有比较特殊的成分虫草素和圣草酚。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

样品：洋河梦之蓝(手工班)。

标准品：虫草素标准品（Cordycepin，北京世纪奥科生物技术有限公司），CAS号为73-03-0，纯度≥98%；圣草酚标准品（Eriodictyol，北京世纪奥科生物技术有限公司），CAS号为552-58-9，纯度≥98%。

检测仪器：气相色谱质谱仪（TSQ，美国Thermo），DB-WAX 色谱柱(30 m×0.25,0.25 μm)；超高压液相色谱（UPLC）和Q-Exactive Orbitrap质谱仪（Ultimate 3000，Q-Exactive Orbitrap，美国 Thermo），C18（100 mm×2.1 mm，1.8 μm）色谱柱；数控型磁力加热搅拌器；SPME手动进样手柄及50 μm DVB/CAR/PDMS(美国Supelco)。

1.2 实验方法

1.2.1 气相色谱检测方法

采用顶空固相微萃取对洋河梦之蓝(手工班)进行萃取，萃取条件为：取7 mL白酒样品、2 g氯化钠(烘干)和1粒搅拌子置于20 mL顶空瓶中，以DVB/CAR/PDMS萃取纤维在45℃恒温萃取5 min，以1500 r/min转速搅拌萃取20 min后，迅速将萃取纤维插入气质联用仪的进样口中以220℃解吸3 min测定。

气相参数：载气为高纯氦气，流速1 mL/min。程序升温：70℃起始，保持3 min，然后以5℃/min升到150℃保留2 min，再以8℃/min升到230℃保留2 min。质谱参数：传输线温度为250℃，EI源，温度230℃。电子轰击能量为70 eV，发射电流为100 μA，预四级杆电压为-7.8 V，采用全扫描模式，扫描范围35～500 m/z。

1.2.2 液相色谱检测方法

采用低温水浴进行样品处理：取500 mL酒样置于蒸发皿中，50℃恒温水浴；在样品完全蒸干后，用500 μL乙醇-水将皿底样品复溶，溶液转移至棕色样品瓶待测。采用40%（v/w）的乙醇溶液作为空白对照，采用同样操作后，转移至样品瓶待测，检测结果作为扣除空白值。

液相参数：Hypersil GOLD C18（100 mm×2.1 mm，1.8 μm）色谱柱；流动相为0.1%甲酸水(A)和0.1%甲酸乙腈(B)；采用梯度洗脱模式，流动相流速为0.3 mL/min；进样盘温度4 ℃；进样量5 μL；柱温40℃。梯度洗脱程序为：5%B(0～5 min)，5%～95%B(5～15 min)，95%B(15～20 min)，5%～95%B(20～21 min)，5%B(21～23 min)。质谱参数，鞘气流量为50 mL/min；辅助气流量为13 mL/min；毛细管温度为300℃；ESI源；扫描范围正、负离子模式均为100～1050 m/z。一级扫描分辨率为70000。

1.3 数据处理

采集的气相色谱质谱数据，根据相应的色谱峰对应的质谱图，采用NIST库进行比对，对其进行定性；采集的液相色谱质谱数据，根据相应的色谱峰对应的质谱图，首先采用SIEVE软件进行分子量的提取，确定其精确分子量，进一步采用HMDB数据库进行比对，选取其中正离子模式质量精度5 mg/L、负离子模式质量精度10 mg/L范围内物质，进一步对筛选出的部分物质进行相应的标准品对照确认。

2 结果与分析

2.1 梦之蓝(手工班)蕴含多种生物活性物质

基于质谱检测数据的比对结果，洋河梦之蓝(手工班)检测出1000余种主要组分，可定性400余种物质，其中包括多种生物活性物质，除常见的脂肪酸和酯类活性物质外，还检测到多种功能性组分，涵盖了酚、呋喃、吡嗪、萜和核苷类似物等不同种类。其中，部分活性物质的生物功效已获得初步研究，比如，乙酸、乳酸具有扩展血管功能[6-7]；丁酸能保护肠黏膜并抑制炎症因子[8]；亚油酸能改善脂代谢[9]；熊脱氧胆酸有出色的利胆功能[10]；亚麻酸及其衍生物具有改善血压作用[11]；亚油酸乙酯具有降低血液中胆固醇和血脂的作用[12]；醋酸氢化可的松具有抗炎、抗病毒等作用[13]；叔丁基对苯二酚有较强的抗氧化能力[14-15]；愈创木酚具有祛痰止咳作用[3]；呋喃它酮具有广谱的抗菌能力[16]；四甲基吡嗪具有多种重要的心血管药理作用[4]；芳姜黄烯具有抗炎和抗肿瘤能力[17]；紫草氰苷具有明显的抗炎活性[18]；乙酰谷酰胺具有改善脑功能和神经功能的作用[19]；1H-异苯并吡喃衍生物具有抗炎和舒张血管等作用[20]。

值得注意的是，我们还检测到白酒中较为少见的两种生物活性成分——圣草酚和虫草素（图1）。圣草酚主要来源于芸香科植物的果实，已有研究显示，其具有较强的抗氧化效果，并具有降血糖和降血脂功效[21-22]。虫草素是蛹虫草中主要的活性成分，是第一个从真菌中分离出来的核苷类抗生素，已有研究显示，其具有抗肿瘤、抗菌抗病毒、免疫调节、清除自由基等多种药理作用，具有良好的临床应用前景[23-26]。这两种物质的检出，可能与洋河酒曲和窖池的独特性有关。

2.2 圣草酚的鉴定与定量

为了测定洋河梦之蓝(手工班)中的圣草酚含量，我们采用超分辨质谱和液相色谱技术，首先确定了圣草酚标准品的保留时间等色谱数据，筛选出酒样中可能的圣草酚信号峰，并以标准品建立浓度标准曲线，定量其中圣草酚的含量。结果显示，检测出的物质峰与圣草酚不仅质谱图一致，其保留时间也完全一致（图2）。采用标准品进行圣草酚含量检测，结果显示，圣草酚含量为1.78 mg/L。