张琪 张红 周强 徐炎硕 王颜红

摘 要 将光子晶体技术和分子印迹技术相结合，制备了分子印迹光子晶体传感器（MIPC），用于检测农药灭多威。以直径320 nm的 SiO2微球制备的光子晶体为制孔模板，灭多威为印迹模板分子，甲基丙烯酸和丙烯酰胺为功能单体，乙二醇二甲基丙烯酸酯为交联剂，经过热聚合后形成凝胶薄膜，将SiO2微球和灭多威分子洗脱后得到灭多威MIPC。通过扫描电子显微镜对聚合物薄膜的形貌进行了表征，发现薄膜中形成了具有典型面心立方结构的三维互连大孔阵列。通过测试其反射峰的位置变化，研究了此MIPC在灭多威溶液中的响应性能，结果表明，MIPC膜对目标分子灭多威具有良好的特异性响应。当灭多威溶液浓度在0～0.02 g/L变化时，反射峰从533 nm红移至589 nm，表观颜色由绿色变为橙红色，响应时间仅为13 min，而与其分子结构相似的克百威则没有出现明显的反射峰位移。测试了此传感器在实际样品中的实用性。当MIPC浸入灭多威含量为0.002、0.02和0.2 mg/L的白菜样品基质溶液时，MIPC反射峰偏移量分别为28、34和42 nm，表明在复杂基质中此传感器具有良好的选择性和高灵敏度的响应能力。

关键词 光子晶體; 分子印迹; 传感器; 灭多威

1 引 言

灭多威（Methomyl）是一种内吸型广谱性氨基甲酸酯类杀虫剂，其杀伤力强、见效快，被广泛用于果树、烟草、蔬菜和棉花等作物害虫的防治[1]。由于灭多威使用量大、溶解性较强、半衰期长[2]，导致在部分水体、果蔬、土壤中均能监测到灭多威残留。灭多威的毒理学研究表明，其具有较强的急性毒性[3～5]、生理生化毒性[6～8]和一定的遗传毒性[9，10]，对生物资源及人类健康造成了严重威胁[11]。因此，需要严格控制水体及果蔬中灭度威的残留量。食品安全国家标准-食品中农药最大残留限量[12]规定，灭多威在果蔬中的最大残留限量为0.2 mg/kg。目前，检测灭多威的方法有气相色谱法[13]、气相色谱-质谱法[14]、高效液相色谱法[15，16]和超高效液相色谱-串联质谱法[17]，尽管这些方法具有高灵敏度、高特异性等优点，但也存在设备要求高、前处理过程复杂、成本高、耗时长等缺点。因此，发展简单、快速、低成本、高灵敏度的检测灭多威的方法十分必要。

光子晶体（Photonic crystal，PC）[18，19]是指介电常数（折射率）在空间呈周期性变化的一类材料，其光子带隙特性可以通过结构色[20]变化直观地反映外界所施加的刺激条件，具有响应迅速、无需标记、裸眼可视等优点，是适用于食品安全快速检测领域理想的光学传感材料。但光子晶体本身没有选择性，用于分析外界刺激时缺乏特异性。

分子印迹技术（Molecular imprinting technique，MIT）以某一特定目标分子为模板分子，构建对该分子具有特异选择识别性能的分子印迹聚合物（Molecular imprinting polymers，MIPs）[21，22]。该技术类似抗体抗原的作用机理，模板分子与功能单体接触会形成多重作用点，除去模板分子后的聚合物中，存在与模板分子在形状、功能基团、空间位置等方面相匹配的立体孔穴，对模板分子表现出高度的选择识别特性[23]。分子印迹聚合物具有预定性和特异性，以及抗恶劣环境能力强、稳定性好、使用寿命长等优点，可作为刺激响应性识别元件应用于光子晶体传感器中。

将分子印迹技术和光子晶体传技术结合，制备出具有分子识别自表达特性的分子印迹光子晶体（Molecularly imprinted photonic crystal，MIPC），其对特定分子识别的过程可直接通过有序大孔的光子晶体衍射光信号表达出来，当衍射光的位置移动较大时，会伴随着结构色的变化，可方便地通过裸眼进行观察。目前，已用于L-多巴胺[24]、香兰素[25]、双酚A[26]、2，4，6-三氯酚[27]、吗啡[28]、辛克宁[29]、红霉素[30]等物质的检测，但对目标物质的检测多限于实验室纯水溶液中，而对实际样品的检测应用较少。薛亚峰等[27]制备了2，4，6-三氯酚传感器，高敏君等[30]制备了红霉素传感器，可用于环境水样中目标分子的识别; 孟梁等[28]制备的吗啡传感器可对吸毒者尿样中的吗啡进行定性检测。本研究以灭多威为印迹模板，制备了具有三维大孔结构的分子印迹光子晶体传感器，并通过光纤光谱仪测试此传感器在蔬菜基质中的响应性，实现了复杂基质中灭多威的快速、灵敏检测。

2 实验部分

2.1 仪器与试剂

USB650光纤光谱仪（美国海洋光学公司）; S-4800扫描电镜（日本日立公司）; 高速离心机（美国赛默飞世尔公司）; JASCO-V630紫外可见分光光度计（日本Jasco公司）; DZF系列真空干燥箱（上海跃进医疗器械有限公司）

灭多威、克百威（98%（w/w），山东华阳科技有限公司）; 甲醇、乙醇、冰乙酸（分析纯，天津市科密欧化学试剂有限公司）; 氨水（分析纯，天津市富宇精细化工有限公司）; 正硅酸乙酯（TEOS，分析纯，天津博迪化工股份有限公司）; 甲基丙烯酸（MAA， 99%（w/w），美国Alfa Aesar化学有限公司）; 偶氮二异丁腈（AIBN，分析纯，天津市大茂化学试剂厂）; 乙二醇二甲基丙烯酸酯（EDMA，99%（w/w），北京百灵威科技有限公司）; 丙烯酰胺（AM，99.9%（w/w），Aladdin公司）; 有机玻璃（75 mm×25 mm）和载玻片（35 mm×25 mm）均购于本地，载玻片在H2SO4-H2O2（7∶3， V/V）溶液中浸泡12 h，并用去离子水洗净干燥后待用。实验用水为去离子水。

2.2 实验方法

2.2.1 单分散SiO2微球及光子晶体模板的制备 采用改进的Stber法制备单分散SiO2微球[31]：在250 mL烧瓶中加入9 mL氨水、16.25 mL无水乙醇和24.75 mL去离子水，1200 r/min磁力搅拌30 min; 将4.5 mL正硅酸乙酯和45.5 mL无水乙醇混合均匀后，快速加入烧瓶中，1 min后将转速调至450 r/min， 恒温水浴35℃反应 2 h，得到乳白色悬浊液，8000 r/min离心，用无水乙醇重新分散、离心，重复洗涤3～4次。将得到的SiO2微球在55℃真空干燥箱中烘干，待用。

光子晶体模板采用垂直沉降法[32]自组装制得。将干燥的SiO2微球超声分散在无水乙醇中，配制成质量分数为1%的悬浊溶液。量取20 mL移入25 mL特制小烧杯中，垂直插入载玻片，放置在恒温30℃的超净间内，待乙醇挥发完全后，在载玻片上自组装形成平整的SiO2光子晶体模板。

2.2.2 灭多威分子印迹光子晶体传感器的制备 采用模板法[33]制备MIPC。取0.16 g灭多威于5 mL离心管中，加入0.5 mL甲醇、335 μL MAA和0.124 g AM，超声混合均匀后，于4℃保存过夜，然后再加入282 μL EDMA、0.01 g AIBN，通氮气10 min除氧，得到聚合溶液。在制备好的光子晶体上覆一片有机玻璃，用夹子夹住两端，向夹层中灌入聚合液，直至光子晶体模板的颜色呈透明，然后置于烧杯中，在60℃油浴中聚合4 h。待聚合反应完成后，将夹子移除，浸泡在5% HF溶液中，直至载玻片脱落，此时在有机玻璃上形成了具有三维大孔结构的分子印迹膜。用甲醇-冰乙酸混合液（18∶1，V/V）反复冲洗有机玻璃，以除去滅多威分子，直至用紫外分光光度计245 nm波长下在洗脱液中检测不到灭多威，然后用去离子水冲洗，即得到灭多威分子印迹光子晶体传感器（MIPC）。将此传感器保存于去离子水中，待用。非印迹光子晶体（NIPC） 的制备方法除不加灭多威外，其它条件相同。

2.2.3 蔬菜样品的检测 白菜样品购于本地超市。将未检出灭多威分子的新鲜白菜粉碎，取20 g，加入40 μL 1 g/L 灭多威溶液，制成灭多威含量为2 mg/kg的白菜样品。取5 g样品，加入50 mL去离子水，匀浆2 min，用滤纸过滤，得到含量为0.2 mg/L的灭多威白菜基质溶液。用同样方法配制灭多威含量为0.2和0.02 mg/kg白菜样品，及0.02 和0.002 mg/L的灭多威白菜基质溶液。

3 结果与讨论

3.1 灭多威分子印迹光子晶体传感器的制备及结构表征

灭多威分子印迹光子晶体传感器的制备如图1所示，通过垂直沉降自组装的方法制备光子晶体模板，随着溶剂的蒸发，分散在无水乙醇中的SiO2微球在毛细管作用力和静电力等作用下整齐地自组装于玻片上，（MIPC）得到面心立方堆积的三维光子晶体结构。在分子印迹过程中，以灭多威为模板分子，甲基丙烯酸和丙烯酰胺为功能单体，乙二醇二甲基丙烯酸甲酯为交联剂，偶氮二异丁腈为引发剂混合在甲醇溶剂中，甲基丙烯酸与灭多威分子以氢键结合，形成稳定的络合物。将聚合液灌入有机玻璃和光子晶体模板的夹层中进行热聚合，灭多威分子便被固定在凝胶聚合物中，将SiO2微球和模板分子除去后，即得到具有三维大孔结构和特定空穴的灭多威分子印迹光子晶体薄膜。这些薄膜内部存在相互连接的大孔，有利于分子的运输。空穴作为特异性识别位点与目标分子结合，则会引起凝胶的溶胀或收缩。丙烯酰胺作为溶胀性功能单体[34]，有利于印迹聚合物在水溶液中溶胀，吸附印迹分子，缩短响应时间。图2是SiO2光子晶体模板和MIPC的扫描电镜图，可见SiO2微球粒径均一，紧密排列呈六方结构（图2A），去除SiO2微球后，呈现了三维有序相互连通的大孔结构（图2B）。

3.2 MIPC的光学性能表征

MIPC的带隙中心波长的检测符合Bragg衍射定律：

其中，λmax为最大衍射峰波长; d为SiO2微球直径，即MIPC中空腔的直径; m是布拉格衍射系数，一般取值为1; D/D0 为MIPC的溶胀率（D和D0分别

表示在一定条件和参考状态下处于平衡状态的凝胶的直径）[35]，当光子晶体为干片时，该值为1; θ为是入射光与基底法线方向上的夹角，实验中θ=0°; na为平均折射系数，ni和fi分别为组成PC或MIPC的各组分的折射率及填充率。由PC和MIPC的反射光谱图（图3）可见，MIPC的衍射峰相较于PC发生了明显蓝移，这是由于组成两者的介质发生了改变，由原来的SiO2微球和空气变成了空气和凝胶聚合物，导致平均折射系数变小，表现为光子带隙发生蓝移。 此外，在除去模板分子后，MIPC的溶胀率变小也是造成光子带隙蓝移的一个重要原因。为使MIPC的衍射峰处于可见光范围，本研究采用直径为320 nm的SiO2微球。

3.3 MIPC对不同浓度灭多威的响应

将制备的MIPC浸入浓度由低到高梯度分布的灭多威溶液中，平衡15 min后，用光纤光谱仪检测其反射光谱。如图4A所示，随着灭多威浓度增加，MIPC的反射峰发生红移，当灭多威浓度由10 14 g/L增加到10 2 g/L时，反射峰由533 nm红移到589 nm，移动距离达56 nm。MIPC在不同浓度的灭多威溶液中的颜色变化见图4B，随着灭多威浓度增加，溶液颜色也由绿色逐渐变为橙红色。这是由于灭多威与MIPC中的特异性识别位点结合，引起凝胶薄膜的溶胀，从而造成晶格参数增大，根据Bragg衍射定律，光子晶体的衍射峰会发生红移，宏观表现为表观颜色的变化。

3.4 MIPC的特异选择性

研究了NIPC在不同浓度灭多威溶液中光子带隙的变化情况。如图5A所示，NIPC的反射峰在灭多威溶液中只有轻微的移动，最大偏移量仅为18 nm，但这种变化没有规律性，表明NIPC对灭多威没有特异性识别能力。同时，考察了MIPC对与灭多威分子结构相似的克百威的响应情况，如图5B所示，MIPC在克百威溶液中光子带隙最大偏移量为17 nm，这可能是由于少量的克百威分子进入凝胶内部引起的。对MIPC和NIPC对灭多威和克百威响应效果进行比较，从图5C可直观看出，MIPC对灭多威具有特异吸附性。上述结果说明，MIPC在多种农药共存时，对目标分子灭多威具有高选择性，能够满足对灭多威的检测要求。

3.5 MIPC在灭多威溶液中的响应时间

将制备的MIPC浸入10 4 g/L灭多威溶液中，每隔2 min检测其反射光谱， 直至反射峰不发生移动。图6为MIPC反射峰随时间的变化谱图，可见最初的7 min内，反射峰移动较大，随着时间增加， 移动距离逐渐减小，13 min后反射峰不再发生偏移，表明基本达到吸附平衡。上述结果说明，此传感器具有快速响应特性，这是用于凝胶膜内具有彼此相互连通的三维多孔结构，有利于目标分子的传输，减低了传质阻抗，因此响应快速。

3.6 MIPC对蔬菜基质溶液中灭多威的检测

考察了制备的MIPC检测蔬菜基质中灭多威残留的实用性。将制备的MIPC浸入到含不同浓度灭多威的白菜样品基质溶液中，平衡15 min后检测其反射光谱，结果见表1。将MIPC浸入灭多威含量0.002、0.02 和0.2 mg/L的白菜样品基质溶液时，MIPC反射峰偏移量分别为28、34和42 nm，表明在复杂基质溶液中，此MIPC保持高选择性和灵敏度，且对蔬菜中灭多威的检出限低于国家标准限量值（0.2 mg/kg）[12]的要求，表明此传感器具有良好的实用性。

4 结 论

将光子晶体技术与分子印迹技术结合，制备了农药灭多威MIPC传感材料，考察了其对灭多威和结构相似分子克百威的响应性及在实际样品检测中的应用。结果表明，制备的MIPC能够实现对灭多威的特异性吸附，响应速度快，灵敏度高，可将待测液的浓度信号转化为直观的颜色信号，实现对目标分子的快速检测。

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