王俊芳，王 淼

(河南大学 生命科学学院，河南 开封 475004)

细菌在细胞低密度状态下所产生的信号分子会很快地扩散；其在高度密集状态下所产生的信号分子可以积聚到较高的浓度，该状态下的菌体细胞能感应自身所产生的信号分子，从而做出相应的协调反应[1]。如：协调菌体的群集运动、感受态的形成、抗生素的合成、γ-聚谷氨酸的合成、生物膜的形成和致病基因的表达等细胞行为。这种对群体密度刺激做出反应的基因调控系统称为群体感应(Quorum sensing, QS)系统[2-5]。对近年来枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)中感受态调控系统ComQXPA(Com是compotence的缩写)的组成、系统在菌体生长繁殖过程中的重要调控机制、枯草芽孢杆菌作为生防菌在农业方面应用的作用机制等方面的研究进展进行了总结，并针对其ComQXPA群体感应系统的调控作用，提出了该系统在生防方面的潜在应用方向。

1 枯草芽孢杆菌ComQXPA群体感应系统的组成

枯草芽孢杆菌中ComQXPA调控系统是菌体的一个重要的QS系统。该系统由comX、comQ、comP和comA等4个调控基因组成，基因的名称是根据它们在系统中的功能命名，研究显示，4个基因中任何1个的突变都会导致细胞感受态的降低[6]。comX编码含有55个氨基酸残基的Pre-ComX前导肽，Pre-ComX 再经comQ基因的编码产物异戊二烯转化酶ComQ的修饰处理，产生由其C末端10个氨基酸残基组成、具有活性的类异戊二烯类多肽信息素ComX[7]；细胞通过相应的转运系统将信息素ComX释放至胞外，其浓度随细胞生长增殖而在胞外逐渐积聚，达到一定阈值时，与一种由comP编码的跨膜信号蛋白，又称为群体信号传感器——一种组氨酸激酶(Histidine sensor kinase)ComP结合，激活该酶，促进其自我磷酸化；磷酸化的ComP(以ComP～P表示)又将磷酸根转移到由comA基因编码的应答调节因子(Response regulator)ComA的天冬氨酸残基上，磷酸化的ComA (以ComA～P表示)被激活；ComA～P又可激活相关下游目标基因的表达，调控细胞响应环境变化。研究发现，comX、comP和comA影响相同系列基因的表达，说明激酶ComP只是信号分子ComX的接收器，而ComA是被ComP直接激活的转录因子，comQ只对ComX前体物Pre-ComX的修饰起作用。ComX、ComP和ComA组成一个专有的调控路径，该路径中信息素和激酶仅调控受ComA影响的基因[8-10]。

由phr基因家族中phrC基因编码的5个氨基酸的多肽CSF (Competence and sporulation factor，感受态和孢子形成因子，也称为外信息素C，phrC)也是参与调节ComA磷酸化的信号分子。由孢子形成早期有关的基因spoOH所编码的σH因子参与启动phrC的转录，CSF蛋白前体物Pre-CSF的合成还在转录水平上受到孢子早期形成基因spoOA和abrB的调节。胞内合成的Pre-CSF通过相应的转运系统被分泌到胞外并转变成有活性的形式CSF[11]。胞外CSF在寡肽通透酶(Oligopeptide permease, Opp)的作用下被转运至细胞内。CSF在群体感应过程中的作用与其在胞内的浓度密切相关。当胞内浓度较低时，CSF可促进感受态的发展，其与磷酸酶RapC结合并抑制其活性，从而降低RapC对ComA～P的脱磷酸化作用，以维持ComA～P的活性状态，保证srfA操纵子的持续转录，从而促进相关基因感受态的发展。因此，在ComX和CSF这2种信息素的共同作用下，通过一个多级的信号转化系统的作用激活晚期感受态基因的表达。CSF在孢子形成的早期起着信号肽的作用而参与孢子形成的调节，随着环境条件的恶化，细菌生长营养物质匮乏，胞内CSF浓度升高达到一定阈值时，促进菌体进入孢子形成阶段[12]。

2 枯草芽孢杆菌ComQXPA群体感应系统的主要调节功能

枯草芽孢杆菌中ComQXPA群体感应系统参与调控多个细胞行为，包括菌体感受态形成、生物膜的形成、胞外降解酶产生、抗生素和胞外多糖的产生、脂肪酸的代谢和运输等行为。

2.1 感受态的形成

细菌的感受态是指该状态下其具有遗传转化的能力，即细胞能够吸附、吸收外源DNA的一种生理状态。枯草芽孢杆菌comS基因是ComQXPA系统中群体感应与感受态之间直接相联系的唯一基因，为嵌入在srfA操纵子上的一个小基因，是积累感受态诱导调节因子Comk(由comk基因编码)所必需的；蛋白接收器MecA(由mecA基因编码)与Comk蛋白结合后，形成的复合物被ClpC-P蛋白酶降解。磷酸化的ComA～P和srfA操纵子结合，激活srfA操纵子的转录，同时包括comS基因的转录，从而产生ComS蛋白，该蛋白质能与蛋白接收器MecA结合，改变其结构，避免MecA与Comk结合，阻止感受态诱导调节因子Comk被ClpC-P蛋白酶降解；Comk激活自身基因comk、comE操纵子及相关下游基因的表达而诱导感受态的形成[13]。

2.2 抗生素的产生

据报道，枯草芽孢杆菌中受ComA调控的操纵子的表达至少涉及5种胞外抗性物质(TasA、bacillomycin D、Surfactins、Sublancin、Sporulation killing factor)的产生，这些抗性物质分别是tasA、bmyA、srfA、sunA、skfA等操纵子的产物，具有多种生物活性，包括具有杀死枯草芽孢杆菌其他菌株细胞和其他种类细菌的能力[14-16]。其中，Surfactins是环7肽的β-羟基脂肪酸，由srfA操纵子转录合成，有关基因srfA-A、comA(srfA-B)和srfA-C编码E1A、E1B和E2等3个单体合成酶，催化表面活性剂中氨基酸残基的连接。srfA-A与comA相隔，ComA激活srfA启动子的转录，SrfA-C负责将羟基脂肪酸转移到SrfA-A蛋白上。另外，还有1个受ComA调控的基因yfmH，其编码产物是一种阳离子肽类抗菌性物质，该抗性物质在营养物质有限的环境条件下，降低敏感细胞对营养物质的竞争能力，从而为枯草芽孢杆菌的生长提供充足的营养[17-19]。

2.3 菌体群集运动和生物膜的形成

ComQXPA群体感应系统参与调控枯草芽孢杆菌细胞的群集运动和生物膜的形成。受ComA直接调控的srfA操纵子是菌体产生脂肽类抗生素所必需的，其产生的脂肽类抗生素除了具有抑菌活性和表面活性，还有助于生物膜和子实体的形成及群体运动[20-22]。研究显示，yve操纵子的一些基因是生物膜形成所必需的[23]，yve操纵子受comA的间接调控，其基因编码产物涉及菌体胞外多糖的产生。comP对菌体群集运动中相关的一些基因起调控作用[24-25]。

在其他类型菌体中，表面活性剂和胞外多糖也有助于菌体细胞的群集运动和生物膜的形成。对于革兰氏阴性菌和阳性菌，它们的群体感应虽然是不同的分子机制调控的，但它们产生表面活性剂和胞外多糖所需要表达的基因都受其群体感应路径所调控[26]。

2.4 胞外降解酶的产生

ComA作为一种调节子，参与调节一些与晚期生长有关的基因如degQ、rapA和rapC的表达。ComA正调控degQ，后者是枯草芽孢杆菌的多效性调控基因，其编码产物DegQ参与调控细胞降解酶(果聚糖酶、碱性金属蛋白酶、α-淀粉酶、β-葡聚糖酶等)的产生和分泌。rapA和rapC编码与感受态和孢子形成控制有关的磷酸酶。许多菌体胞外降解酶的产生受群体感应系统的调控[27]。可能体现在，积累大量的胞外酶，以降解足够的聚合物，供给菌体所需营养。Pel基因受ComQXPA群体感应系统直接调控，其编码果胶酸盐裂解酶，表达量随菌体密度增大而增加。果胶酸盐裂解酶可降解植物组织成分，在革兰氏阴性菌和其他革兰氏阳性菌中果胶酸盐裂解酶的产生也受群体感应的调控。另外，不同类型细菌产生的涉及菌体—植物互作的产物，也受其群体感应的调控[28-29]。

2.5 运输和分泌

几个编码运输器蛋白的基因都受ComQXPA群体感应系统调控。这些编码运输器蛋白和涉及抗生素合成的基因是共转录的,如：编码输出功能的基因skfEFGH(ybdABDE基因也是编码输出功能的基因)与涉及编码合成抗生素物质的基因skfABCD(ybcOPST)共转录；编码运输器的基因ycxA受srfA操纵子上游基因的连续转录所影响；还发现1个操纵子上的sipW基因是编码信号肽酶的基因，该基因与1个产生抗性物质所必需的基因tasA共转录[30]。另外，TasA有助于生物膜的形成。由于运输功能基因与生物合成功能基因共转录，编码相应物质合成的功能基因也受ComQXPA群体感应系统所调控[31-32]。

2.6 脂肪酸代谢

涉及脂肪酸代谢的fapR基因受ComA的调控。其自动调整和控制多个涉及脂肪酸代谢的基因，编码产物FapR是转录阻遏物，fapR、plsX、fabDG操纵子，yhdO、fabHB、fabHAF操纵子和fabL基因等涉及脂肪酸代谢的基因或操纵子都受FapR的调控或影响，也直接或间接受ComA的调控[33-34]。

目前，已鉴定出9个转录单位的22个基因受ComQXPA路径直接调控，近150个基因的表达受该路径间接调控。这些受调控的基因大体涉及3个方面的功能：(1)调节涉及发育途径中的生理变化；(2)调节高浓度培养物条件下产生有效胞外产物的行为；(3)在拥挤或限制扩散的条件下增强菌体生存、生长和定殖能力。

3 枯草芽孢杆菌在农业生防方面的应用

枯草芽孢杆菌作为农作物生防菌的研究很多，其生防机制主要包括以下几个方面。

3.1 产生脂肽类抗生素

高学文等[35]构建的枯草芽孢杆菌工程菌GEB3菌株，能够产生表面活性素，其对稻瘟病病原菌和小麦纹枯病病原菌菌丝具有抑制作用。肖晓露[36]研究发现，枯草芽孢杆菌BS193菌株可产生伊枯草菌素、丰源菌素和表面活性素等3种脂肽类抗生素，抗菌作用广谱，对辣椒疫病有显著的抑制作用。杨桃[37]筛选到1株编号为Itb的枯草芽孢杆菌，其对烟草疫霉菌引起的烟草黑胫病有60%以上的大田防治效果；对生防菌发酵液进行分离提取，结果显示，其分泌的表面活性素为主要的抗菌成分。

3.2 产生抗菌蛋白

郑小亮等[38]筛选到生防菌枯草芽孢杆菌Z1-2菌株，其产生的抗菌蛋白具有耐热和耐紫外线特性，对小麦赤霉病有显著的抑制效果。于杰等[39]研究发现，枯草芽孢杆菌B25菌株产生一种抗菌蛋白，其对香蕉枯萎病病原菌有较强抑制作用，致使菌丝和孢子膨大畸形。牛焕杰[40]从小麦根部分离到1株编号为E1R-j的枯草芽孢杆菌，该菌对由黑腐皮壳菌(Valsamali)引起的苹果树腐烂病有较好的防治效果；对其发酵液进行分离提取及纯化，抗菌活性成分为多肽，对病原菌菌丝有显著的抑制作用，导致菌丝膨大和原生质外渗等现象。

3.3 产生降解酶类

韩长志等[41]研究发现，枯草芽孢杆菌XF-1菌株可分泌多种碳水化合物酶类(Carbohydrate-active enzymes, CAZymes)，对多种植物病原菌有显著的抑制作用。LIU等[42]对枯草芽孢杆菌SL-13菌株研究发现，该菌株具有分泌几丁质酶的特性，对番茄立枯病有较好的防治效果，且对番茄具有促生作用。

3.4 形成生物膜

王培培等[43]对枯草芽孢杆菌NCD-2菌株的comA基因突变子研究发现，生物膜形成有利于对番茄灰霉菌的抑制作用。

4 枯草芽孢杆菌ComQXPA系统在生物防治方面的潜在应用

枯草芽孢杆菌的生防机制与其ComQXPA系统的调节作用紧密相关，随着枯草芽孢杆菌 ComQXPA系统分子调控机制的深入研究，一些受直接调控的基因被克隆，构建了一些高产分泌物的工程菌。顾晓波等[44]利用comA的超表达构建枯草芽孢杆菌MO-L010菌株脂肽合成工程菌，脂肽产量提高了20%。ZHANG等[45]从棉花中分离出1株枯草芽孢杆菌ZK0，其产生的脂肽类抗生素iturin A能抑制农作物病原真菌的生长，通过comA和sigA基因的超表达构建工程菌，极大提高了iturin A的产量，可用于商业化生产。陆兆新等[46]以枯草芽孢杆菌ATCC9943为出发菌株，通过超表达comA基因，构建了高产抗菌肽菌株FB27。利用ComQXPA系统的调控机制，有方向性地构建生防效果更好的工程菌，是研究人员努力的方向。

5 展望

关于枯草芽孢杆菌ComQXPA系统的调控机制，人们还在进行着深入的研究。对于该调控系统在生防方面的应用，提出以下建议：分析清楚菌株的生防机制，如从强化生物膜的形成、加强抗性物质的分泌以及提高生防菌的定殖能力等方面进行研究，利用代谢工程策略优化相应合成途径，构建高产工程菌，增强枯草芽孢杆菌的生防效果。随着研究的深入，ComQXPA系统的调节作用在枯草芽孢杆菌生物防治方面将具有巨大的应用潜力。