王 丹，孙敬蒙

（1.长春中医药大学药学院，长春 130117；2.吉林大学白求恩第一医院药学部，长春 130021）

随着我国人口老龄化程度的加剧，骨质疏松症发病率也随之升高[1-2]，其最大的危害是骨质疏松性骨折，且前臂远端骨折一直被认为是典型的骨质疏松性骨折[3-5]。骨密度作为骨质疏松症的预测指标[6-8]，其保健食品的开发引起了医药工作者的高度关注，鹿茸补骨片主要采用吉林省道地药材马鹿茸与黄芪配伍为君药[9]，《本草纲目》记载[10]，鹿茸能够起到养血益阳，强筋健骨，治一切虚损、耳聋、目暗、眩晕虚痢作用[11-12]。为进一步证实鹿茸补骨片增加骨密度的功能，本研究综合分析了其对骨密度及骨钙含量等指标的影响，并对鹿茸补骨片进行急性经口毒性试验，初步对原料毒性特性进行评估，本文研究内容可为鹿茸补骨片保健食品的研发及增加骨密度机理研究提供实验基础和理论依据。

1 材料

1.1 试验动物与条件 SPF 级SD 大鼠和SPF 级ICR小鼠购自辽宁长生生物技术有限公司，实验动物许可证号：SCXK（辽）2015-0001，在SPF级动物实验中心（屏障环境）饲养（许可证号：SYXK（黑）2011007），温度为21 ～23 ℃，湿度为55%～58%。试验动物所用的清洁级饲料购自北京科澳协力饲料有限公司（许可证号：SCXK(京)2014-0010）。

1.2 样品 鹿茸补骨片，由哈尔滨久盛医药科技开发有限公司，以马鹿茸、黄芪、骨碎补、熟地黄为原料，样品为异形片剂，0.53 g/片（约每片含生药马鹿茸0.24 g，黄芪0.78 g，骨碎补0.52 g，熟地黄0.78 g），推荐成人（60 kg 计）用量为2 片/次，2 次/d。

1.3 仪器与试剂 双能X 线骨密度仪（上海伊沐医疗器械有限公司）、原子吸收分光光度计（北京达丰瑞仪器仪表有限公司）、电子天平（梅特勒-托利多仪器有限公司）、精密卡尺（东莞市三本精密仪器源头厂）、动物解剖器械、灌胃针、注射器等均购自吉林省金泰化玻有限公司；主要试剂如硝酸、高氯酸为优级纯，氧化镧、碳酸钙及盐酸等均为分析纯由吉林省金泰化玻有限公司公司。

1.4 剂量设计 样品推荐用量为2 次/d，2 片/次，0.53 g/片，因此每人2.12 g/d。成人体质量以60 kg 计，则样品用量相当于0.035 g/ kg·bw。以人体推荐量的5 倍，即每日0.175 g/kg·bw 为低剂量，另设2 个剂量组：0.35 g/kg·bw （人体推荐量的10 倍为中剂量）和1.05 g/kg·bw （人体推荐量的30 倍为高剂量）。同时设空白对照组（灌胃去离子水），以及假手术+去离子水组和卵巢切除+去离子水组。

2 功能性试验

2.1 试验方案 雌性SD 大鼠50 只，适应性饲养5 d后随机分成5组，每组10 只。去势手术安排：假手术+去离子水组，鼠经腹腔注射30 mg/kg·bw 的戊巴比妥钠溶液麻醉，在严格无菌操作下，腹位固定后于腹中线距阴道口3 ～4 cm 处去毛，分别用碘酒和酒精消毒，待稍干后切开皮肤和腹肌约2 ～3 cm，腹肌和皮肤分层缝合后，再次消毒。最后经后肢肌肉注射2 万U 青霉素；卵巢切除组+去离子水组和雷允上牌固葆片三个剂量组，麻醉方法同上，在严格无菌操作下，腹位固定后于腹中线距阴道口3 ～4 cm 处去毛，分别用碘酒和酒精消毒，待稍干后切开皮肤和腹肌约2 ～3 cm，切口视野可见白色脂肪，拨开脂肪层找到子宫后，轻轻将一侧子宫角拉出，在其末端可见被脂肪团包裹的卵巢。分离脂肪团，便可见粉红色或黄红色的卵巢，以止血钳夹住卵巢，然后将卵巢下输卵管（包括脂肪）用丝线结扎，剪除卵巢（检查是否完全剪除），顺势将子宫角送回腹腔中，同法剪除另侧卵巢，腹肌和皮肤分层缝合后，再次消毒。最后经后肢肌肉注射2 万U青霉素。为保证手术成功，大鼠摘除卵巢后5 d，进行阴道涂片检查（用滴管吸取少量生理盐水，轻轻插入阴道1 ～2 cm，冲洗数次后吸出，涂于玻片上，镜下观察），1 次/d，连续7 d，以检查大鼠卵巢是否完全摘除；如涂片呈动情反应（镜下见大量半透明、扁平的表皮细胞），表明动物卵巢切除不完全，应弃去不用[13-14]。

切除大鼠双侧卵巢7 d 后，按照1.4 剂量设计，卵巢切除三个剂量组（灌胃液的配制：分别取鹿茸补骨片1.75 g，3.5 g，10.5 g，加去离子水定容至100 mL，配制成0.175 g/kg·bw，0.35 g/kg·bw，1.05 g/kg·bw的灌胃液）；经口给予假手术+去离子水组和卵巢切除+去离子水组动物等容积的去离子水。所有动物灌胃剂量均为10 mL/kg·bw，1 次/d，连续灌胃90 d，每周称体质量并按体质量调整灌胃量。

2.2 骨密度测定 将待测股骨放置测量台上，与骨密度仪探测头移动方向垂直，移动待测股骨，令其待测点标记线与探测头移动轨迹与测量台上的垂直投影重合。开始测量，每个点测量2 次，2 次测量误差不大于10%。将2 次结果取平均值[15-16]。

2.3 骨钙含量测定 取大鼠一侧股骨，在105 ℃烘箱中烘干至恒重后，精密称重和精密测量长度，记录数值。将股骨研成粉末，精密称取适量（0.300 ～1.000 g），置于150 mL 三角瓶中，上盖小漏斗，加入混酸（硝酸：高氯酸= 4：1）15 ～20 mL，在电热板上加热消化直至冒白烟并透明无色。消化液透明无色后加入少量去离子水，煮沸，除去剩余的酸，重复2 次，最后消化液体积不超过1 mL。空白对照为相同体积的混酸，按照样品处理相同方法消化制得。以原子吸收法测定骨钙含量[17]。

2.4 数据处理 采用SPSS 软件进行数据分析。先进行方差齐性检验，方差齐，计算F值，F＜F0.05，结论：各组均数间差异无显著性；F≥F0.05，P≤0.05，用多个实验组和一个对照组间均数的两两比较方法进行统计；对非正态或是方差不齐的数据进行适当的变量转换，待满足正态或是方差齐要求后，用转换后的数据进行统计；若是变量转换后仍未到达正态或是方差齐的目的，改用秩和检验进行统计。

2.5 结果判定 本产品属不含钙的产品，卵巢切除+去离子水组（模型对照组）骨钙含量或骨密度显著低于假手术组（空白对照组），表明造成大鼠骨密度低下模型；卵巢切除+受试物组的骨钙含量和骨密度较卵巢切除+去离子水组显著增加，而其他指标（体质量除外）不显著低于卵巢切除+去离子水组，可判定受试物具有增加骨密度功能作用。

3 急性经口毒性试验

选用SD 大鼠和ICR 小鼠各20 只，雌雄各半，体质量分别为180 ～220 g 和18 ～22 g。大、小鼠购买后在本实验室适应环境5 d，采用最大耐受量试验方法，禁食16 h后24 h内经口灌胃二次[18]。取鹿茸补骨片50 g，溶于去离子水中并定容至100 mL 大、小鼠的灌胃容积均为20 mL/kg·bw，灌胃剂量均为20.0 g/kg·bw（相当于推荐剂量的666.7 倍）。观察大、小鼠的中毒表现和死亡时间，观察时间为14 d。

4 结果

4.1 受试样品对大鼠体质量的影响 由表1可见，初始体质量、给样前（去势手术后）各组体质量无显著性差异（P＞0.05）；实验从第1 周开始卵巢切除+去离子水组体质量显著高于假手术+去离子水组（第1 周P＜0.05，第2 周以后P＜0.01），90 d喂养中给予受试物各剂量组体质量显著高于假手术+去离子水组（P＜0.01），而与卵巢切除+去离子水组无显著性差异（P＞0.05）。

表1 受试样品对大鼠体质量的影响（n = 10） g

4.2 鹿茸补骨片对骨钙含量的影响 由表2可见，给予受试物90 d 后，卵巢切除+去离子水组骨钙含量和总钙量显著低于假手术+去离子水组（P＜0.01），各组与卵巢切除+去离子水组相比，股骨重量略低，但没有显著性差异（P＞0.05），造模成功；受试物组骨钙含量和总钙量有不同程度增高，其中，中、高剂量组（即卵巢切除+ 0.35组和卵巢切除+1.05组）骨钙含量和总钙量均显著高于卵巢切除+去离子水组（P＜0.01）。

表2 去卵巢大鼠股骨重量和骨钙含量变化（n = 10）

4.3 鹿茸补骨片对大鼠骨密度的影响 由表3可见，给予受试物90 d 后，卵巢切除+去离子水组骨密度显著低于假手术+去离子水组（P＜0.01），中、高剂量组股骨中心骨密度和股骨远心端骨密度均显著高于卵巢切除+去离子水组（P＜0.01）。

4.4 急性经口毒性试验结果 见表4、5、6。

5 讨论

鹿茸补骨片由四味中药配伍，相得益彰，共奏补血填精，固肾健骨之功效[19-20]，适用于骨痿（骨质疏松）以五脏虚衰，肾枯髓竭证，以周身骨痛，腰背酸软疼痛，常易抽筋、多汗，下肢痿软无力，不能持重为主要临床表现者[21-22]。综合试验结果分析可知，给予鹿茸补骨片90 d 后，中、高剂量组均能显著提高去卵巢大鼠骨密度，低、中、高剂量组均能显著提高去卵巢大鼠骨钙含量，其他指标如体质量、股骨长度、股骨重量等均不显著低于模型组。根据《保健食品检验与评价技术规范》2003年版判定标准，判定鹿茸补骨片具有增加骨密度功能作用。在14 d的观察期间内，两性别大、小鼠一般状态良好，未出现任何中毒症状，无动物死亡。根据试验所设计的剂量，观察到的结果及大、小鼠急性毒性判定标准，可以认为鹿茸补骨片大、小鼠经口最大耐受量大于20.0 g/kg·bw，且属无毒级，也可作为其他毒理学试验剂量的依据。

表3 受试样品对大鼠股骨长度和骨密度的影响（± s，n = 10） g/cm2

表3 受试样品对大鼠股骨长度和骨密度的影响（± s，n = 10） g/cm2

注：与假手术+去离子水组比较，## P ＜0.01；与卵巢切除+去离子水组比较，△△P ＜0.01

股骨远心端骨密度（g/cm2）假手术+去离子水 0.210±0.012△△ 0.254±0.030△△卵巢切除+去离子水 0.189±0.020## 0.200±0.018##卵巢切除+ 0.175 g/kg·bw 0.203±0.012 0.214±0.020##卵巢切除+ 0.35 g/kg·bw 0.209±0.016△△ 0.218±0.019##△△卵巢切除+ 1.05 g/kg·bw 0.215±0.018** 0.226±0.029##**组 别 股骨中心骨密度（g/cm2）

表4 鹿茸补骨片大、小鼠急性经口毒性试验体质量（± s ，n = 10） g

表4 鹿茸补骨片大、小鼠急性经口毒性试验体质量（± s ，n = 10） g

动物 性别 剂量/（g/kg·bw） 初始体质量 1 周末体质量 2 周末体质量小鼠 雄 20.0 20.3±1.4 25.8±1.4 30.3±2.6雌20.0 images/BZ_125_794_1287_798_1287.png 20.2±1.3 25.0±1.5 29.0±1.4大鼠 雄 20.0 201.4±11.2 241.4±7.7 293.0±8.8雌20.0 199.8±14.1 235.1±6.0 280.5±8.8

表5 鹿茸补骨片大鼠急性经口毒性试验结果（n = 10） g/kg·bw

表6 鹿茸补骨片小鼠急性经口毒性试验结果（n = 10） g/kg·bw