杨 旭 任 珍

(1. 安康学院现代农业与生物科技学院，陕西 安康 725000；2. 陕西省富硒食品工程实验室，陕西 安康 725000)

茶渣是茶叶经冲泡饮用或活性成分提取加工后的副产物[1]，含有丰富的纤维素、木质素、蛋白、多酚、多糖、皂素等功效成分[2-3]。茶渣中蛋白约15%～30%[4]，且以碱溶性蛋白为主，占蛋白总量的55.06%[5]。研究表明，茶渣蛋白具有高的疏水性，溶解度较差[6]39[7]1-2，因此乳化性、乳化稳定性、表面张力和黏度等功能性质方面不利于在食品中的应用。

为了提升茶渣蛋白的功能特性，目前已报道的改性方法有限制性酶解法和挤压膨化法。王洪新等[8]利用酶法水解改性后，茶渣蛋白的溶解性、起泡性、乳化性提高，但泡沫稳定性和乳化稳定性均有所降低。黄梦姣等[9]通过挤压改性法，使绿茶渣的水溶性提高了7.41%，但挤压膨化中高温高压对产品的色泽、营养价值等的不良影响，使其他改性方法的探究具有发展空间。

糖基化改性是利用蛋白质—糖的接枝反应形成共价复合物，实现对蛋白质的化学改性。此方法已应用于燕麦[10]、米渣[11]、玉米[12]等蛋白的改性，但在茶渣蛋白中的应用还未见报道。本试验拟以湿法糖基化对茶渣蛋白进行改性，探究糖基供体种类、反应物比例、pH、温度和时间对糖基化效果的影响，并分析改性前后茶渣蛋白的溶解性、乳化性和乳化稳定性、起泡性和泡沫稳定性的变化情况。以期为糖基化改性法在茶渣蛋白中的应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 材料与试剂

绿茶：安康市紫阳县向阳茶厂；

葡萄糖、葡聚糖、乳糖、麦芽糊精：分析纯，北京酷尔化学科技有限公司；

牛血清白蛋白标准品：纯度≥98%，上海江莱生物科技有限公司；

其他试剂均为分析纯。

1.1.2 仪器与设备

紫外可见分光光度计：TU-1901型，北京普析通用仪器有限责任公司；

低速离心机：LD4-2A型，北京医用离心机厂；

恒温振动水浴锅：SHA-C型，常州国华电器有限公司；

电热恒温鼓风干燥箱：GZX-GF101-2-BS型，上海跃进医疗器械有限公司；

真空冷冻干燥机：SCIENTZ-50N型，宁波新芝生物科技股份有限公司；

旋转蒸发仪：RE-52AA型，上海亚荣生化仪器厂。

1.2 方法

1.2.1 原料预处理 绿茶原料以料液比1∶110(g/mL)加水于85 ℃下冲泡30 min，重复2次[13]，抽滤后剩余的茶渣在50 ℃下干燥至恒重，粉碎过60目筛，备用。

1.2.2 茶渣蛋白的提取 根据预试验所得的优化提取工艺，茶渣样品用0.075 mol/L NaOH溶液以1∶60(g/mL)的料液比在54.2 ℃下水浴振荡提取4 h，浸提液经添加4%双氧水在50 ℃下脱色，并于pH 3.5下等电点沉淀后，冷冻干燥。

1.2.3 糖基供体的选择及评价指标测定

(1) 茶渣蛋白—糖的共价复合物制备：参考王成波[14]的方法略作修改。以0.075 mol/L NaOH溶液复溶茶渣蛋白，使蛋白质量浓度为1.2%，取20 mL按1∶1的质量比加入不同糖基供体，磁力搅拌20 min使其混合均匀。用0.1 mol/L HCl溶液或0.1 mol/L NaOH 溶液调节pH至11.0，磁力搅拌5 min。将茶渣蛋白—糖混合液置于90 ℃下水浴加热反应一定时间，并在冰浴中冷却5 min 以终止反应，所得样品液于4 ℃冷藏待用。

(2) 接枝度测定：采用邻苯二甲醛法[15]。

(3) 褐变指数测定：参照Sun等[16]的方法，以反应体系在420 nm下的吸光度值为褐变指数。

(4) 溶解性测定：根据张蓓等[10]的方法修改如下，将共价复合物样品液冷冻干燥后，配制成1 mg/mL复合物溶液，9 000 r/min离心15 min，采用考马斯亮蓝G-250法测定上清液中的蛋白质含量，并按式(1)计算溶解性。

(1)

式中：

SI——溶解性，%；

P1——上清液中蛋白质含量，μg/mL；

P0——样品中总蛋白质含量，μg/mL。

(5) 乳化性及乳化稳定性测定：参照文献[17]，配制1 mg/mL的共价复合物样品液进行测定。

(6) 起泡性及泡沫稳定性测定：参照文献[18]，配制1 mg/mL的共价复合物样品液进行测定。

1.2.4 茶渣蛋白—糖共价复合物的制备工艺优化

(1) 茶渣蛋白与糖的质量比对糖基化效果的影响：将茶渣蛋白与选择的糖基供体分别按照2∶1，1∶1，1∶2，1∶3，1∶4的质量比进行混合，在90 ℃、pH 11.0条件下反应2 h，其他步骤按1.2.3(1)所述制备共价复合物。

(2) 体系pH对糖基化效果的影响：将茶渣蛋白与选择的糖基供体按照1∶1的质量比进行混合，分别调节pH至8.0，9.0，10.0，11.0，12.0，于90 ℃下反应2 h，其他步骤按1.2.3(1)所述制备共价复合物。

(3) 温度对糖基化效果的影响：将茶渣蛋白与选择的糖基供体按照1∶1的质量比进行混合，调节pH至11.0，分别于60，70，80，90，100 ℃下反应2 h，其他步骤按1.2.3(1)所述制备共价复合物。

(4) 响应面试验设计：根据单因素试验结果，以质量比、pH和反应温度为自变量，接枝度为响应值，进行三因素三水平的Box-Behnken响应面试验。

1.2.5 数据分析 所有数据以(均值±标准差)表示，每次样品的测定均重复3次。采用SPSS 19.0进行方差分析和差异显著性分析(P<0.05即为差异显著)。其中，响应面设计试验数据以均值表示，采用Design Expert 8对数据进行二次多项式回归拟合分析。

2 结果与分析

2.1 糖基供体的确定

2.1.1 不同糖基供体的糖基化效果分析 图1为茶渣蛋白分别与葡萄糖、葡聚糖、乳糖、麦芽糊精在0～4 h反应过程中接枝度的变化曲线。随着反应时间的延长，接枝度均呈先增加后降低的趋势。4种糖基供体中，乳糖的接枝度最高，反应1 h即为(35.38±0.79)%，其次为葡萄糖，反应2 h后达到最高接枝度(31.58±0.83)%，而葡聚糖和麦芽糊精在受试时间内的接枝度均未超过15%。葡萄糖、乳糖含有较多的还原性羰基，更容易与茶渣蛋白发生接枝反应，而葡聚糖、麦芽糊精的相对分子质量较大，支链的空间位阻效应则限制了反应的进行[10]。

图1 反应时间对不同茶渣蛋白—糖复合物接枝度的影响

Figure 1 Effect of reaction time on the graft degree of the different tea residue protein-saccharide complexes

茶渣蛋白与葡萄糖、葡聚糖、乳糖、麦芽糊精进行糖基化反应的时间对产物褐变指数的影响如图2所示。4种糖基供体产物褐变指数的变化趋势一致，在0～4 h反应时间内不断增大，且表现为：葡萄糖>乳糖>麦芽糊精>葡聚糖。结果表明，葡萄糖和乳糖与茶渣蛋白的反应更为剧烈，能够较快进入美拉德反应的高级阶段，从而形成褐变物质[19 ]。

2.1.2 不同糖基供体的产物功能特性分析 表1为不同糖基供体与茶渣蛋白形成共价复合物的功能特性测定结果。从表1中数据可知，茶渣蛋白—葡萄糖复合物的溶解性、乳化性和起泡性明显高于其他3种糖基供体，而乳化稳定性与泡沫稳定性则是葡聚糖最高，葡萄糖次之。

图2 反应时间对不同茶渣蛋白—糖复合物褐变 指数的影响

Figure 2 Effect of reaction time on the browning index of the different tea residue protein-saccharide complexes

表1 不同茶渣蛋白—糖复合物的功能特性†

† 同列字母不同表示差异显著(P<0.05)。

因此，综合接枝度、褐变指数、功能特性各项指标，最终选择葡萄糖作为茶渣蛋白糖基化改性的最适糖基供体。

2.2 茶渣蛋白—糖共价复合物制备的工艺优化

2.2.1 单因素试验

(1) 茶渣蛋白与糖的质量比对糖基化效果的影响：由图3可知，开始时，随着葡萄糖的添加比例增大，反应底物间的接触增多，加速了美拉德反应的进程，接枝度在茶渣蛋白与糖的质量比为1∶1时达到最大值，为(31.15±0.51)%。而后此作用效果减弱，加之体系黏度随葡萄糖的添加比例增大而提高，导致底物间的接触反而受到限制。褐变指数却随质量比的增大而呈现不断上升的趋势，且在质量比超过1∶3时上升幅度增大，可能与副反应(如焦糖化)的发生有关[11]。因此，确定茶渣蛋白与葡萄糖的适宜质量比为1∶1～1∶3。

图3 茶渣蛋白与葡萄糖的质量比对糖基化效果的影响

(2) 体系pH对糖基化效果的影响：由图4可知，随着体系pH的不断增大，接枝度呈先增加后降低的趋势，而褐变指数则持续上升。当pH为11.0时，接枝度达到最大值，为(31.86±0.81)%。由于提取得到的茶渣蛋白为碱溶性，pH值的提升促使蛋白质的溶解性增加，有利于反应的进行。随后，极端pH值使氨基的反应性降低，枝度有所下降，但茶渣中的多酚与蛋白质等物质在碱性、湿热作用下的氧化反应会加剧褐变程度。因此，确定反应体系的适宜pH为10～12。

图4 体系pH对糖基化效果的影响

(3) 温度对糖基化效果的影响：由图5可知，接枝度和褐变指数先随反应温度的升高而逐渐增加，当温度为80 ℃时，两个指标分别达到(31.88±0.54)%和(1.441±0.017)。此阶段反应温度的升高使蛋白质受热展开，与葡萄糖的反应位点增加，反应加快。当蛋白分子上共价结合的糖链增长，位阻效应的存在使反应受到限制，同时过高的温度也会使茶渣蛋白的营养价值降低，但高温却促使了焦糖聚合物的形成[20]，使褐变指数继续升高。因此，确定适宜的反应温度为70～90 ℃。

图5 温度对糖基化效果的影响

2.2.2 响应面试验 根据单因素试验的结果，糖基化效果的两个衡量指标中，褐变指数是美拉德反应高级阶段的重要表征，但褐变程度过大对产品的色泽会造成不利影响；接枝度则反映了共价复合物主链上葡萄糖的接枝程度，其越大越有利于接枝反应[21]。因此，以接枝度为响应值，进行三因素三水平的响应面试验设计(表2)，具体试验方案及结果见表3。

采用Design Expert 8软件对试验数据进行二次多项式回归拟合，得到的回归方程如下：

Y= 31.42-1.12A-1.49B+1.82C+0.11AB-1.08AC-0.30BC-1.34A2-2.06B2-3.49C2。

(2)

表2 Box-Behnken试验设计因素水平表

表3 Box-Behnken试验结果

表4 回归模型的方差分析结果†

† *表示P<0.05，**表示P<0.01。

图6为各因素交互作用对接枝度影响的响应面图。通过该组图的曲线走势和等高线形状，可反映出3个考察因素中任意两个因素交互作用的强弱，其中茶渣蛋白与糖的质量比、反应温度的交互作用对接枝度影响显著，与方差分析结果一致。根据拟合的多元回归方程，最终计算得到的最优组合为茶渣蛋白与糖的质量比1∶1.42、体系pH 10.60、反应温度83.68 ℃，此时接枝度的理论值达到32.38%。为确定所得到的优化工艺对茶渣蛋白的改性效果，进行验证实验。此反应条件下，测得产物的接枝度为(32.89±0.53)%，与理论最佳值基本一致，说明此改性方案合理可行。

2.2.3 改性前后茶渣蛋白的功能特性测定 在优化的改性工艺基础上，制备得到茶渣蛋白—葡萄糖共价复合物，分别测定改性前后蛋白质的功能特性，结果见表5。改性前，茶渣蛋白的溶解性仅为(55.31±1.41)%，与其较高的疏水性氨基酸含量有关；乳化性和对乳状液的稳定能力分别为(0.205±0.007)%和(25.16±0.69)%，与夏秀芳等[17]报道的大豆分离蛋白的乳化性(0.160%)和乳化稳定性(25.75%)相当；起泡性较差，与其溶解性较差有关，而维持泡沫的稳定能力为(57.45±2.57)%。

经过糖基化改性后，测定的功能特性均有不同程度的提高。溶解性增加了35.78%，较溶解性增加24%的限制性水解法[7]40-41和7.41%的挤压改性法[9]，效果更为理想。改性后茶渣蛋白的乳化性是改性前的3.02倍，乳化稳定性增加了10.72%，优于限制性水解改性后茶渣蛋白乳化性7%的提高和乳化稳定性的降低[6]34-35。起泡性增加了29.95%，不及酶法水解改性后起泡性的改善效果(增加79%)，泡沫稳定性虽较其他功能特性的提升不明显，但优于酶法水解改性[8]。

图6 因素交互作用对接枝度的影响

茶渣蛋白溶解性/%乳化性乳化稳定性/%起泡性/%泡沫稳定性/%改性前55.31±1.410.205±0.00725.16±0.69117.56±1.9057.45±2.57改性后91.09±1.850.620±0.01135.88±1.14147.51±2.5560.68±1.84

3 结论

本研究从糖基化反应的接枝度、褐变指数和蛋白功能特性3方面考察，选定葡萄糖为最适的糖基供体。以接枝度为响应值，茶渣蛋白与葡萄糖的质量比、体系pH和反应温度为因子，通过响应面试验设计建立二次多项回归模型，确定茶渣蛋白的优化改性工艺为茶渣蛋白与葡萄糖的质量比1∶1、体系pH 10.60、反应温度83.68 ℃。此改性条件下，茶渣蛋白的溶解性、乳化性及乳化稳定性、起泡性及泡沫稳定性较改性前均有提升，说明糖基化改性法可用于茶渣蛋白的功能特性改善。后续可对改性茶渣蛋白在具体食品模型中的应用进行研究，以利于茶渣资源的合理开发。