令利军 张 玺 郑生岳 史苗霞 冯娟娟 焦正龙 李子彬

（1 西北师范大学生命科学学院 甘肃兰州 730070 2 甘肃农业职业技术学院农业技术系 甘肃兰州 730020）

0 引言

植物内生菌（Endophyte）通常是指存在于高等植物组织和器官内的真菌、细菌及酵母菌。其在植物体内具有相对稳定的生存空间， 可以在植物体内独立的繁殖和传递。 近年来研究结果表明内生菌在植物体内具有生物防治的生态位， 具有促进植物生长、抗病虫害、加强宿主的抗逆境等功能。基于以上研究基础， 植物内生菌作为当前生物防治资源的优良材料， 已经逐渐成为国内外的研究热点， 从植物中分离出的内生菌是获得天然产物及开发新药物的潜在资源［2-3］。

哈密瓜（Cucumis melo var. saccharinus）隶属于葫芦科，又称雪瓜、贡瓜等，是一类优良的甜瓜品种［5］。 为了解哈密瓜内生菌的生物多样性，并对其内生菌进行分离鉴定， 从而进一步研究内生菌与宿主的关系及为内生菌的开发应用奠定基础［4］。

1 哈密瓜内生菌分离与纯化的实验流程及教学活动组织

1.1 哈密瓜内生菌分离与纯化的实验流程 样品的制备→表面消毒→内生分离、 纯化→形态观察→分析结果→种属确定［1］。

1.2 教学活动组织 中职教育的最终目标是培养应用技能型人才， 实践能力是最为重要的环节之一。实践教学对学生技能的培养有着深远意义，通过实验教学， 学生亲自动手实践不断加深理论知识，并将掌握的理论知识升华为操作技能。此次教学设计可将班级学生按小组形式进行实验，每小组6～8 人，组长负责制［10-11］。 由这6～8 人共同查阅文献，确定实验方案，其中2 名学生准备实验材料和仪器；1 名学生做好实验的记录工作；实验过程中每一步骤均由2 名学生轮流合作完成。 实验全程由教师参与指导。

2 哈密瓜内生菌分离与纯化教学实验步骤

2.1 材料与试剂 冷藏条件下的哈密瓜（4℃）；NA、PDA 和YPD 培养基［4］。

2.2 仪器与设备 电子天平（HTP-312）；生化培养 箱（Blue Pard）；超 净 工 作 台（BSC-1300ΙΙA2）；电 热 鼓 风 干 燥 箱 （GZX-9030MBE）； 柜 型 冰 柜（FCD-196SE）；压力蒸汽灭菌锅（DSX-280B）；超声波清洗器（KQ5200B）。

2.3 方法

1）样品的采集与制备。选取生长状况良好，表面无机械损伤，成熟的瓜作为样品，并放置4℃冷藏。

2）表面消毒。 第1 步，取样。 在超净工作台里分别在哈密瓜的不同部位（皮层，浅层，深层）取1 cm2的组织块若干，将组织块消毒处理。 用无菌水冲洗3 遍，第3 遍的无菌水涂布于培养基，作为消毒对照。

第2 步，制备菌悬液。在超净工作台里用灭过菌的研钵将组织块捣碎、研磨。 按需加入无菌水，按比例分别制备稀释倍数为10-3、10-4、10-5的菌悬 液 备 用［6］。

第3 步，涂布。在超净工作台里将备用菌悬液分别在NA、PDA 和YPD 培养基进行涂布， 浅层、皮层和深层的菌悬液各涂布于3 种培养基， 进行编号。 NA 培养基在37℃下培养1～2 d，PDA 和YPD 培养基在28℃下培养3～5 d。

第4 步，记录实验结果，并观察菌落形态特征。

第5 步，参考《酵母菌特征与鉴定手册》、《常见细菌系统鉴定手册》和《真菌鉴定手册》，根据菌落的形态特征，生长速度，边缘形态，颜色和大小，是否透明等方面，进行确定。

3）样品的分离。 待培养基中长出肉眼可见的菌落时，根据菌落的颜色差异及形态特征，挑取不同的菌落接于新的培养基上，进行编号，NA 培养基在37℃下培养1～2 d，PDA 培养基和YPD 培养基在28℃下培养3～5 d， 观察菌落的生长速度和形态特征，记录观察结果。

4）样品的纯化。 根据菌落形态特征选取合适的培养基，重复划线操作，直至纯化为单菌落，并进行编号，NA 培养基在37℃下培养1～2 d，PDA培养基和YPD 培养基在28℃下培养3～5 d，观察菌落形态特征，记录观察结果。

5）菌种的保藏。采用甘油保存法：将要保存的菌种接种于LB 液体培养基，培养至对数生长期，即肉眼能看见培养体系内浑浊即可。 将甘油稀释至浓度为30%。 在无菌条件下将菌液与30%浓度甘油1∶1 等体积混合于离心管中， 甘油的最终浓度为15%。 可于-80℃冰箱内保存2 年。

3 结果与分析

内生菌分离的结果：实验中均利用菌悬液涂布法，对哈密瓜的皮层、浅层、深层的内生菌进行分离，分别在皮层分离出菌落形态不同的4 株，在浅层分离出菌落形态不同的2 株，在深层分离出菌落形态不同的2 株。 分离出的8 株内生菌中，细菌有6 株，占总菌数的75%；酵母有2 株，占总菌数的25%（表1、图1，图1 见封四）。

表1 哈密瓜内生菌菌落形态特征

4 实验结果分析与讨论

整个实验结束后由教师组织学生按小组讨论， 再由组长将讨论结果整合后向全班学生做汇报。 讨论主要围绕以下2 个方面进行：第一，围绕实验所获得的菌种， 引导学生讨论植物中存在哪几类内生菌， 这些内生菌与植物宿主的关系及这些内生菌有哪些应用价值；第二，实验结果不佳的小组， 由小组成员共同分析讨论是哪个环节出了问题，如何改进实验方案，最后由教师总结评价并给出标准化实验方案以供学生参考。

哈密瓜内生菌的分离过程中， 要对哈密瓜的表面和组织块灭菌，并做好实验对照，即用第3 遍冲洗消毒后组织块无菌水进行涂布。 在灭菌时不但要将表面的细菌杀死， 还要确保不能伤到内部的细菌，整个实验在无菌的条件下进行。

本实验表明，哈密瓜皮层、浅层和深层组织中均存在内生菌，且内生菌具有一定的多样性。内生菌由于与宿主植物长期共处， 进而形成了一种复杂、特殊的关系，它们有的是互利共生关系，而有的是无害或微害寄生关系，2 种关系可随多种因素变化而相互转化［12］。 内生菌在生物制药方面具有较大的应用前景， 利用内生菌生产生防菌剂代替化学农药等［13］。

5 学生收获

5.1 专业素养方面 学生通过实验，对内生菌的相关知识产生了浓厚的兴趣， 初步掌握了内生菌分离与纯化的操作步骤及关键环节和注意事项，能对实验结果进行分析讨论， 能找出实验失败的原因及解决问题的方法［8］。

学生对使用灭菌锅、 超净工作台等实验仪器设备操作娴熟， 掌握了如何制备培养基和菌悬液方法，提高了学生对实验现象的观察，数据分析处理等专业素养。

5.2 情感态度价值观方面 培养学生自主学习新知识、新技术；能通过各种媒体资源收集所需信息； 能独立制定工作计划并实施； 能独立进行调查、对比、分析；具有团队协作、创新能力及持之以恒的精神等［7］。