杨卓 王新军○☆ 付旭东 曾凡涛 王修成 周少龙 张旭阳

基础领域针对胶质瘤分子标志物的研究，为胶质瘤分子学机制、靶向药物的研制提供了至关重要的理论基础。异柠檬酸脱氢酶1(isocitrate dehydrogenase 1,IDH1)[1]对胶质瘤的分级以及预后判断有重要的意义。F框/WD-40域蛋白7（FBox and WD40 domain protein 7,Fbxw7）为一种重要的肿瘤抑制因子，参与细胞的增殖、分化、凋亡、癌变等过程[2]。既往有文献报道其在胶质瘤组织中的应用价值[3]。针对上述两种蛋白在胶质瘤组织中的潜在研究价值，我们通过免疫组织化学法，蛋白质印记法检测胶质瘤组织中Fbxw7的表达与分布，并探讨Fbxw7的表达与IDH1之间的关系。

1 资料与方法

1.1 一般资料选取2012年1月1日至2015年12月31日于郑州大学第五附属医院神经外科治疗的86例胶质瘤患者的胶质瘤组织标本。纳入标准：①由影像学、病理明确诊断为胶质瘤；②初次发病，首次手术切除；③术前未接受放疗，化疗及其他治疗；④无其他神经系统疾患。排除标准：①术前发生脑疝、肿瘤卒中者；②术后随访期各种原因死亡者；③精神心理异常者。同时选取30例头颅外伤去骨瓣内减压患者脑组织作为对照组。胶质瘤WHOⅠ级10例，其中毛细胞型星形细胞瘤8例，室管膜下巨细胞型星形细胞瘤2例；Ⅱ级38例，Ⅲ级26例，其中少突胶质细胞瘤14例，间变性星形细胞瘤12例；Ⅳ级12例。对所有纳入研究的患者进行为期36个月的随访。本研究已告知患者家属并取得知情同意。兔多克隆抗体Fbxw7购于Abcam公司 （货号ab109617），兔多克隆抗体IDH1、鼠/兔通用型S-P超敏试剂盒、二氨基联苯胺（DAB）显色液、NC膜购于北京索莱宝科技有限公司，荧光显微镜购自日本Nikon公司。

1.2 Fbxw7、IDH1分布检测86例标本在离体后迅速经10%甲醛固定，常规石蜡包埋。标本做连续切片，置于防脱剂预处理后的载玻片上，滴加Fbxw7抗体4℃过夜，磷酸缓冲液（PBS）清洗后滴加生物素标记二抗，室温孵育20min,PBS清洗加辣根过氧化物酶标记链霉卵白素工作液，室温孵育15min，DAB显色液显色，冲洗，苏木精复染等后于显微镜下观察。选择每张切片免疫反应较强的区域，高倍镜视野（×400）观察5个不重复视野，计数Fbxw7阳性细胞，IDH1蛋白免疫组化按照同样类似方法进行。其中：阳性细胞百分比≤25%为1分，≤50%为2分，≤75%为3分，＞75%为 4分；根据染色程度评分：无染色者为0分，淡黄色者为1分，黄色或棕褐色者为2分，褐色者为3分。最后以两者评分的总和为最终评分，0分为阴性，1～7分为阳性，其中1～3分为低表达，4～7分为高表达。

1.3 Fbxw7、IDH1蛋白印迹检测用剪刀剪取少许新鲜冰冻组织并将其剪碎后置入1.5 mL EP管中，加RIPA裂解液至0.5 mL，充分溶解离心后提取上清。根据BCA显色法，制作标准曲线，得出系数R2=0.995，估算出蛋白浓度。加入4×loading buffer，保证蛋白浓度5 mg/mL左右，煮沸后备用。配置12%分离胶，5%浓缩胶，按照电泳、转NC膜、一抗孵育、过夜后二抗孵育、显色、曝光，得出蛋白条带。过程中严格按照操作程序进行。

1.4 统计学方法采用SPSS 21.0进行统计学分析。计量资料用均数±标准差（x±s）表示，免疫组化中肿瘤组织与对照组织，低病理级别（Ⅰ、Ⅱ级）与高病理级别（Ⅲ、Ⅳ级）组织中Fbxw7、IDH1的表达采用单因素χ2检验，蛋白印记中蛋白表达差异采用两独立样本t检验；Fbxw7蛋白表达与临床病理参数的关系采用单因素 χ2检验；Fbxw7与IDH1的表达相关性采用关联系数r表示，检验水准均为 α=0.05。

2 结果

2.1 Fbxw7在脑组织中的表达Fbxw7蛋白在肿瘤组织中的表达主要在胞浆中，可见黄色或棕黄色的颗粒物质，其阳性表达率为83.72%，对照组中Fbxw7阳性表达率为46.67%，肿瘤组织中Fbxw7 的表达明显高于对照组中（χ2=15.927，P＜0.01）；低病理级别肿瘤组织中Fbxw7蛋白的阳性表达率为93.75%，高病理级别组织中Fbxw7蛋白的阳性表达率为71.05%，低病理级别中Fbxw7蛋白阳性表达率明显高于高病理级别组织，差异存在统计学意义（χ2=8.017，P＜0.01），见表 1，图 1。

2.2 IDH1在脑组织中的表达IDH1在肿瘤组织胞核中呈现黄色或棕褐色的颗粒物质，少量见于胞浆和胞膜中，其在肿瘤组织中阳性率为86.06%，对照组中阳性率为66.67%，肿瘤组织中IDH1的表达明显高于对照组中 （χ2=5.435，P=0.023）；低病理级别肿瘤组织中IDH1蛋白的阳性表达率为79.17%，高病理级别组织中IDH1蛋白的阳性表达率为94.73%，高病理级别中IDH1蛋白阳性表达率明显高于低病理级别组织，差异存在统计学意义（χ2=4.282，P=0.036），见表 2，图 2。

2.3 Fbxw7蛋白质印记应用Image Lab 5.2.1软件，将实验标本Fbxw7蛋白的光密度条带与内参GAPDH蛋白条带值进行相比，所得值代表Fbxw7蛋白表达水平，对照组0.73±0.11，肿瘤组2.75±0.83,低级别 3.22±0.51，高级别 1.86±0.53，胶质瘤组织中Fbxw7蛋白表达高于阴性对照组 （t=-13.251,P＜0.01），低病理级别中 Fbxw7蛋白表达水平较高病理级别组织明显升高（t=10.445,P＜0.01）,见图 3。

2.4 IDH1蛋白质印记同样的方法，所得值代表IDH1蛋白表达水平，对照组0.27±0.07，肿瘤组0.68±0.20,低级别 0.47±0.12，高级别 0.80±0.13，胶质瘤组织中IDH1蛋白表达高于阴性对照组（t=-10.838,P＜0.01），高病理级别中 IDH1 蛋白表达水平较低病理级别组织明显升高（t=-11.051,P＜0.01），见图 3。

2.5 Fbxw7的表达与相关参数的关系肿瘤直径、病理级别、癫痫发作情况、IDH1的表达影响Fbxw7的表达（P＜0.05），且 Fbxw7与 IDH1的表达相关性关联系数r=0.51，而年龄，性别，头晕病史、胶质瘤细胞成分，术前KPS评分、肿瘤部位与Fbxw7 的表达无关(P＞0.05)，见表 3。

3 讨论

肿瘤研究已逐渐转化至基因水平、信号传导通路。既往我们研究了胶质瘤多个分子标志物[4]，对胶质瘤的基本生物学特征有了初步的了解。Fbxw7蛋白属于F-box蛋白家族的一员，能特异性地识别和降解泛素-蛋白酶体系统（UPS）中的底物蛋白，在细胞周期调节、转录调节、凋亡和细胞信号转导中具有重要作用，Fbxw7突变和缺失可导致染色体不稳定，加速癌细胞增殖相关基因的积累，如myc、cycline等[5]。最近的研究表明，Fbxw7被认为是一种针对各种致癌蛋白的肿瘤抑制因子，Fbxw7基因突变和缺失能引起这些与癌细胞增殖相关基因的积累，且已经在卵巢癌、乳腺癌、结直肠癌和胶质瘤中被发现[6-7]。

图1 胶质瘤组织和对照组织中Fbxw7的表达（×400）。A：对照组织中Fbxw7的染色;B：胶质瘤WHOⅠ级中Fbxw7的染色;C：胶质瘤WHOⅡ级中Fbxw7的染色;D：胶质瘤WHOⅢ级中Fbxw7的染色;E：胶质瘤WHOⅣ级中Fbxw7的染色

图2 胶质瘤组织和对照组织中IDH1的表达（×400）。A：对照组织中IDH1的染色;B：胶质瘤WHOⅠ级中IDH1的染色;C：胶质瘤WHOⅡ级中IDH1的染色;D：胶质瘤WHOⅢ级中IDH1的染色;E：胶质瘤WHOⅣ级中IDH1的染色

图3 蛋白印迹法检测脑组织中Fbxw7、IDH1蛋白的表达水平。1：对照组织；2：胶质瘤组织；3：低病理级别胶质瘤组织；4：高病理级别胶质瘤组织；GAPDH：甘油醛-3-磷酸脱氢酶

表1 Fbxw7在不同组织中的表达差异

表2 IDH1在不同组织中的表达差异

本研究表明，Marker标记Fbxw7的分子量约70kDa，在胶质瘤组织中，低级别中阳性率明显高于高级别阳性率，既往学者研究表明，在胶质母细胞瘤中，Fbxw7的表达显著降低，且可作为胶质母细胞瘤患者的生存标志[3]，另有学者研究乳腺癌时称Fbxw7蛋白在乳腺癌组织和细胞系中表达水平下降[8]。上述结论与我们的研究结果基本符合，我们的猜测是：Fbxw7作为各种致癌蛋白的抑制因子，在低级别胶质瘤中尚可发挥其抑制作用，表现出较高的阳性表达，然而在高级别胶质瘤中，肿瘤高复杂性致使Fbxw7蛋白的功能受到更大程度的限制，其抑制能力显著下降，表现为阳性表达逐渐下降，具体原因还需进一步实验验证。既往对IDH1蛋白的研究已经相当深入，目前IDH1已被WHO作为胶质瘤的分级指标[9]，本研究中Marker标记IDH1的分子量约45kDa,IDH1蛋白在胶质瘤组织中明显表达，且随着胶质瘤级别的升高而表达升高（P＜0.05），有文献称IDH1的不同程度表达与胶质瘤恶性程度存在一定的相关性，且未处理的低级别胶质瘤，极易转变为胶质母细胞瘤[10]，因此IDH1用来研究胶质瘤的生物学特征，将有重要意义。本研究结果显示Fbxw7蛋白的表达与IDH1 存在相关性（P＜0.05，r=0.51），且两者在不同胶质瘤级别的表达呈相反趋势，是否存在相关上下游通路或拮抗关系尚不清楚。

表3 Fbxw7的表达与临床病理参数分析（例）

肿瘤直径直接反应肿瘤体积大小，Fbxw7蛋白与肿瘤直径相关，可能是随着肿瘤体积的增大，Fbxw7蛋白功能受到影响所致。本研究显示低级别肿瘤组织中Fbxw7蛋白的阳性率高于高病理级别阳性率，此结论于其他文献也有类似报道[3]，可能是Fbxw7的生物功能受到更多的抑制，从而在高级别胶质瘤中表达下降，提高肿瘤复杂程度，增加治疗难度，有研究显示：Mir-223/Fbxw7通路是许多人类癌症（如胃癌、乳腺癌和非小细胞肺癌）耐药机制的重要线索[11]。因此，从Fbxw7入手，解决高级别胶质瘤复发率，提高化疗药物控制率，可能是潜在的突破口。癫痫的发生对于胶质瘤本身而言，提高了胶质瘤的检出率，既往我们课题组已经明确多个肿瘤标志物与癫痫发作存在相关性[12]，本研究显示Fbxw7与胶质瘤中癫痫存在相关性，文献报道癫痫多发生于低级别胶质瘤中[13]，且与我们本研究得出的结论：Fbxw7在低级别胶质瘤阳性率升高相吻合，至于具体机制，还需相关实验来验证。另外，随着对胶质瘤研究的逐步深入，针对特定胶质瘤病理类型的研究，为个体化的单一治疗显的尤为重要，本研究限于标本数量，结果显示Fbxw7与少突胶质瘤并无相关性，可能是Fbxw7在少突胶质瘤中并无特异性，此方面结论还需在扩大样本量的基础上做多中心、多角度的探索。

总之，本研究通过对Fbxw7、IDH1蛋白在胶质瘤组织中的表达情况及其之间的关系，对胶质瘤的机制有了新的认识，从诊断角度来说，Fbxw7蛋白有望用来反映胶质瘤的生物特征，然而Fbxw7蛋白通过何种途径改变胶质瘤的侵袭生长机制，Fbxw7蛋白的不同表达对胶质瘤患者的预后影响如何，将是我们下一步工作的重点。