蒋莹 程永乐 曹代京 陈有君 李国光 闫伟

摘要为了探明环境pH对褐环粘盖牛肝菌（Suillus luteus（L.：Fr.）Gray）生长代谢的影响机理，研究不同pH条件下液体培养褐环粘盖牛肝菌菌丝中蛋白质和核酸的含量变化，结果显示：该菌在pH 3.0～6.0范围内，随着pH的增加，蛋白质及核酸的含量逐渐增加，并在pH 6.0时达到最高值;在pH 6.0～8.0范围内，蛋白质及核酸的含量迅速降低。蛋白质的含量和RNA、DNA的含量之间极显著相关，相关系数分别达0.923和0.977，DNA和RNA的含量之间也极显著相关，相关系数达0.927。该研究可为进一步探索褐环粘盖牛肝菌适应与调节环境pH机理方面提供依据。

关键词褐环粘盖牛肝菌;pH;蛋白质;核酸

中图分类号S646.3文献标识码A文章编号0517-6611（2019）02-0004-03

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2019.02.002

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褐环粘盖牛肝菌（Suillus luteus（L.：Fr.）Gray）是分布于我国甘肃、内蒙古[1]、陕西、黑龙江、西藏、辽宁以及广东等地的外生菌根真菌，不同地区土壤的酸碱度不同导致菌丝体的生长状况不尽相同[2-3]，所以环境pH对该菌的影响引发大量学者的研究讨论。张茹琴等[4]发现该菌的最适生长pH为5.3～6.7，且培养后培养基的pH降低。雷增普等[5]通过大田试验发现，该菌具有抗碱能力（土壤pH 8.6）。姚庆智等[6]发现该菌在pH 6～7时生长最为旺盛。宋微等[7]研究发现，该菌在pH 4.0～8.0的固体培养基上能生长，且最适pH为5.0，在pH小于5.0或者大于6.0时，该菌的增长速度减缓，菌苔变薄。刘淑清等[8]通过试验发现，含有柠檬酸-磷酸二氢钾缓冲液且pH为4.5的培养基中该菌的生物量最高，当pH大于4.5时，菌丝的生物量随着pH的增高而逐渐降低[8]。刘强等[9]研究发现，在NaCl浓度为0.1 mol/L且pH为6.0时，该菌长势最好，随着环境pH的增加，菌体受到的抑制作用也愈加明显。刘杨[10]研究不同培养基、pH、碳氮源等因素对该菌的影响，发现该菌在Pach培养基上的最适生长pH为4.5。王明慧[11]发现该菌的蛋白含量随着pH的升高而升高，在pH为5.0时增长速率最大，且在pH 7.0时蛋白含量达到最大值，达到峰值后蛋白质含量迅速下降。刘萌[12]发现该菌在pH 5.0～6.0时分泌的有机酸最多，生长状况最好。但是，环境pH对该菌核酸含量的影响还缺少研究。

通过对多种丝状真菌的研究发现，生物响应外界环境酸碱性的改变是通过自身基因表达的改变来实现的[13]。嗜水气单胞菌在中性或偏酸性（pH 7.0和pH 5.0）环境中，4种毒性基因可以表达，而在碱性环境中仅仅只有1种基因可以表达[14]。贾海锋等[15]通过不同pH处理草莓果实叶片的试验，发现随着pH的增加基因表达量呈显著上升趋势，并在pH 6时获得最大值。沈静等[16]发现低pH严重影响水稻根系细胞中细胞膜质子泵基因的表达，在pH 5.5时该基因的表达量最高。有研究表明，细胞膜质子泵的最高活性范围为pH 6.0～6.5[17-18]，pH通过影响其活性进而影响其表达量。以上说明环境pH会对生物体的基因产生影响。虽然部分研究学者针对pH与褐环粘盖牛肝菌之间的关系做了大量研究，但从蛋白质及核酸含量方面研究该菌与环境pH之间关系的报道目前还不是很多。笔者研究了该菌在不同pH培养下蛋白质和核酸的含量变化，以期为深入了解褐环粘盖牛肝菌生理学及其改变环境pH的调控机制提供依据。

1材料与方法

1.1试验处理

将在Pach培养基中培养7 d的褐环粘盖牛肝菌Sp9菌株（由内蒙古农业大学菌根技术研究室提供）转接到不同pH（灭菌后pH为3.0、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、7.0和8.0）的液体培养基中，每瓶接入11块，150 mL三角瓶装液量为50 mL，置于25 ℃恒温培养箱中静置培养，并每天更换其培养基，5 d后滤出菌丝，备用。

1.2试验方法

1.2.1蛋白质的测定。

取0.01 g菌丝用液氮冷却后于冰浴中进行研磨，加入1 mL研磨缓冲液后装入离心管中于-4 ℃、6 000 r/min条件下离心5 min。取上清液，再次置于离心管中，并于-4 ℃、10 000 r/min条件下离心10 min，获得上清液。用考马斯亮蓝法测定蛋白质含量（以牛血清蛋白溶液为标准液，用考马斯亮蓝法做标准曲线：y=85.816x-1.098 6，其中x为吸光度，y为蛋白质含量，线性相关系数r为0.999，根据标准曲线计算出8个样品中相应蛋白质的含量）。

1.2.2RNA含量的测定。取0.01 g菌丝用液氮冷却后在冰浴中充分研磨至粉末，按照RNAprep Pure 多糖多酚植物总RNA提取试剂盒（天根公司）所提供的方法提取该菌的总RNA，并溶于ddH2O中，取1 μL RNA ddH2O溶液于Biodrop中检测RNA含量。

1.2.3DNA含量的测定。取0.01 g菌丝用液氮冷却后于冰浴中充分研磨至粉末，按照植物基因组DNA提取试剂盒（天根公司）所给的方法提取该菌的总DNA，并溶于ddH2O。取1 μL DNA ddH2O溶液于Biodrop中进行DNA含量检测。

2结果与分析

2.1pH对褐环粘盖牛肝菌蛋白质含量的影响

不同环境pH培养5 d后菌丝体的蛋白含量如图1所示。由图1可知，当pH小于6时，蛋白质含量随着pH的升高而逐渐上升，在pH为3.0～4.5时，蛋白质的含量上升缓慢，每增加1个单位的pH，蛋白质平均增加215.79 ng;在pH 4.5～5.0范围内，单位pH的蛋白质增长量極其微小，仅增加43.07 ng;在pH为5.0～6.0时，蛋白质含量迅速增长，单位pH的蛋白质增长量高达714.35 ng，且在pH 6.0时蛋白质的含量达到最高值;达到峰值后，随着pH的增加，蛋白质含量逐渐降低，在pH为6.0～8.0时，蛋白质含量显著下降，单位pH的蛋白质减少量达到330.59 ng。就整体趋势而言，蛋白质含量受环境pH的影响较大，在pH 6.0的条件下，蛋白质含量最高，推测pH 6.0为该菌的最适生长pH。

2.2pH对褐环粘盖牛肝菌RNA含量的影响

不同环境pH培养5 d后菌丝体的RNA含量如图2所示。由图2可知，当pH小于6时，RNA含量随着pH的升高而升高，在pH为3.0～4.5时，RNA含量增长缓慢，环境pH每增加1个单位，RNA含量增加77.30 ng;在pH为4.5～6.0时，RNA含量显著增加，平均环境pH每增加1个单位，RNA含量的增长量可达283.79 ng，并在pH 6.0时达到峰值，为639.60 ng/mg。此后，随着pH的增加，RNA含量开始下降，在pH为6.0～7.0时，RNA含量逐渐减少，单位减少量为150.38 ng;在pH为7.0～8.0时，RNA含量迅速下降，单位pH的RNA减少量达到313.16 ng，说明在碱性环境下不利于RNA的合成。就整体趋势而言，环境pH对RNA含量影响较大，RNA含量在pH 6.0时获得最大值，因此推测该菌的最适生长pH为6.0。

2.3pH对褐环粘盖牛肝菌DNA含量的影响

不同环境pH培养5 d后菌丝体的DNA含量如图3所示。由图3可知，当pH小于6.0时，DNA含量随着pH的升高而逐渐上升，在pH为3.0～4.0时，DNA含量增长缓慢，单位pH的DNA增加量为62.44 ng;在pH 4.0～4.5时DNA含量几乎不变;在pH 4.5～6.0时，DNA含量显著增加，单位pH的DNA增加量可达90.23 ng，并在pH 6.0时DNA含量达到最大值;在pH 6.0～8.0时，DNA含量快速下降，单位pH的DNA减少量可达59.21 ng。就整体变化趋势而言，DNA含量受環境pH影响较大，DNA含量在pH 6.0时最高，因此推测该菌的最适生长pH为6.0。

3结论与讨论

3.1褐环粘盖牛肝菌蛋白质含量与RNA含量的相关性

由图4可以看出，蛋白质含量随RNA含量的增加而增加，相关分析表明二者之间具有极显著的相关关系（相关系数r=0.923，P<0.01）。菌丝中蛋白质含量与RNA含量的线性回归方程为y=1.5722x+1 832.1。

通过对图1和图2进行对比发现，在pH 3.0～6.0的培养条件下，蛋白质与RNA的含量都随着pH的升高而逐渐上升，其中在pH 3.0～4.5时，RNA含量的增加速率明显高于蛋白质含量的增长速率，单位菌丝体中平均1 ng RNA可以翻译为14.859 ng蛋白质;在pH 4.5～6.0时，蛋白质含量增长率高于RNA含量增长率，单位菌丝体中平均1 ng RNA可以翻译为6.441 ng蛋白质，虽然翻译率下降，但由于转录率较高，获得的RNA含量较高，所以依然获得较高的蛋白质含量，并在pH 6.0的培养条件下蛋白质含量达到峰值，说明在该pH范围内更利于蛋白质的合成;在pH 6.0～8.0的培养条件下，二者的含量都明显下降，单位菌丝体中平均1 ng RNA可以翻译为7.732 ng蛋白质，虽然翻译率有所提高，但由于该范围的环境pH培养条件下RNA的合成量逐渐降低，因此翻译获得的蛋白质含量依然呈下降趋势，尤其在pH 7.0～8.0时，RNA含量的下降速率比蛋白质的下降速率更大。

3.2褐环粘盖牛肝菌蛋白质含量与DNA含量的相关性

由图5可以看出，蛋白质含量随DNA含量的增加而增加，相关分析表明二者之间具有极显著的相关关系（相关系数r=0.977，P<0.01）。菌丝中蛋白质含量和DNA含量的线性回归方程为y=5.452 4x+1 466.9。

通过对图1和图3进行对比发现，在pH 3.0～6.0的培养条件下，蛋白质和DNA的含量都随着pH的增加而增加，其中在pH 3.0～4.5时，DNA的增长率接近蛋白质增长率的7倍，说明在该pH范围内，更有利于DNA的合成，单位基因的表达量不大，导致蛋白质含量的增加速率缓慢，但是在pH 4.5～6.0 的培养条件下，蛋白质的增长率迅速增加，即基因的表达量显著增加，说明在该pH范围内更有利于基因的表达。在pH 6.0～8.0的培养条件下，二者含量均显著下降，其中，在pH 6.0～7.0时，DNA含量的减少率明显高于蛋白质含量的减少率，说明在该环境pH下更不利于DNA的生成;在pH 7.0～8.0时，二者含量均继续下降接近于最低值，说明在碱性条件下不利于该菌基因的表达。

3.3褐环粘盖牛肝菌RNA含量与DNA含量的相关性

由图6可知，RNA含量随DNA含量的增加而增加，相关分析表明二者之间具有极显著的相关关系（相关系数r=0.927，P<0.01）。菌丝中RNA含量与DNA含量线性回归方程为y=3.037 1x-161.93。

通过对图2和图3进行综合分析，可以发现，在pH 3.0～4.5的培养条件下，单位菌丝体中平均1 ng DNA可以转录为1.443 ng RNA;在pH 4.5～6.0的培养条件下，单位菌丝体中平均1 ng DNA可以转录为2.254 ng RNA，转录率有所提高，并在pH 6.0的培养条件下获得最高RNA含量;在pH 6.0～8.0的培养条件下，单位菌丝体中平均1 ng DNA可以转录为1.956 ng RNA，转录率有所下降，说明该范围的环境pH下，不利于RNA的合成。

综上所述，在pH 3.0～6.0的培养条件下，褐环粘盖牛肝菌菌丝体中蛋白质和核酸的含量都随着pH的增加而逐渐增加，并在pH 6.0时获得峰值，此后随着pH的增加其含量均显著降低。该结果与孙琳[19]、蔡楠楠[20]在pH 6.0获得最大生物量的结果相吻合，因此，可以认为弱酸性环境下更有利于褐环粘盖牛肝菌的生长，并且该菌的最适生长pH为6.0。

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