曹端广，夏汉庭，杨文龙，杨 佛，刘 璞，李 威，王书豪，杨凤云

(1.江西中医药大学临床医学院，江西 南昌 330000；2.江西中医药大学附属医院，江西 南昌 330000)

骨质疏松症(osteoporosis，OP)是以骨微结构破坏，骨骼强度下降，骨量丢失为典型特征的一种骨代谢性疾病。其具有高发病率、高致残率的特点，危害巨大，是仅次于心血管疾病的第二大高发疾病[1-2]。随着人口的老龄化，OP的发病率也在持续上升。据统计，目前中国的OP患者约有9 000万人，到2050年将骤增至2亿多人，占总人口的13.2%[3]。

加味阳和汤是江西中医药大学附属医院骨伤科国家级名老中医许鸿照的经验方，由阳和汤加鸡血藤、木瓜、汉防己发展而来。许鸿照在临床诊治OP的过程中发现，OP患者多有肾阳虚的表现，而加味阳和汤具有“补肾、温阳通络”之功，在临床上有针对性地运用于肾阳虚型OP患者，取得了较好的临床疗效。

在临床经验总结的基础上，本实验从基础医学的角度出发，通过维甲酸灌胃、氢化可的松臀部肌肉注射复制肾阳虚型OP模型大鼠，检测大鼠股骨骨密度(bone mineral density，BMD)及血清微量元素的变化，探究加味阳和汤对肾阳虚型OP模型大鼠的治疗作用及其可能机制。

1 材料

1.1 实验动物 雌性SD大鼠48只，3月龄，体质量(180±20)g，购自江西中医药大学实验动物科技中心[动物生产许可证号：SCXK(赣)2018-0003]。

1.2 主要仪器 Hologic QDR-2000型双光能骨密度仪、Bio-Tek ELx800型连续波长酶标仪：美国生产；W2-100SP型旋转蒸发仪：上海申生。

1.3 药物及试剂 维甲酸(存货编号 R817255)、羧甲基纤维素钠(存货编号 C804638)：上海麦克林生物科技有限公司；氢化可的松(国药准字 H12020885，每支2 mL，含氢化可的松10 mg)：天津金耀药业有限公司；戊酸雌二醇(estradiol valerate，E2V；国药准字 J20130009，每片1 mg)：拜耳医药保健有限公司广州分公司；碱性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)检测试剂盒：北京四正柏生物科技有限公司；抗酒石酸酸性磷酸酶(tartrate-resistant acid phosphatase，TRAP)检测试剂盒：武汉华美生物工程有限公司；镁(magnesium，Mg)、铁(ferrum，Fe)、锌(zinc，Zn)检测试剂盒：南京建成生物工程研究所。

2 方法

2.1 不同浓度加味阳和汤的制备 加味阳和汤[鸡血藤20 g，熟地黄15 g，肉桂、鹿角胶(烊化)、麻黄、白芥子、汉防己各10 g，木瓜、炮姜各6 g，甘草3 g]饮片均购于江西中医药大学附属医院中药房，按照比例取饮片浸泡、滤过，由江西中医药大学药学院中药标准化研究实验室制备成煎剂，分别减压浓缩至每毫升含生药0.5、1、2 g，4 ℃冰箱下保存备用。

2.2 肾阳虚型OP模型鼠的制备 维甲酸用1%羧甲基纤维素钠混悬，按每日80 mg/kg灌胃给药，持续2周，同时每日臀部肌肉注射氢化可的松，剂量为2 mg/kg，复制肾阳虚型OP大鼠模型。模型复制完成后，取正常及模型组大鼠行BMD检测，观察大鼠是否有神疲、乏力、静卧、小便多等肾阳虚表现。确认模型复制成功后，将48只正常大鼠及制备的肾阳虚型OP模型鼠分为空白对照组，模型组，加味阳和汤低、中、高剂量组，阳性对照组，共6组。各组药物制成溶液后，分别用等容积1%羧甲基纤维素钠、不同浓度(5、10、20 g/kg)加味阳和汤、E2V(0.000 2 g/kg)灌胃(10 mL/kg)，连续6周。

2.3 大鼠一般情况观察 观察模型复制过程中及给药过程中大鼠的活动、精神、毛发、体质量、食欲、食量、大小便等的变化。

2.4 骨及血清标本的采集与检测 用乌拉坦将大鼠麻醉后，从腹主动脉取血，室温静置30 min，6 000 r/min离心10 min，分离血清，置于-20 ℃冰箱保存。应用ELISA试剂盒检测血清ALP、TRAP，采用比色法检测血清Mg水平，采用分光光度法检测血清Fe、Zn水平。取大鼠右侧股骨，采用美国 Hologic QDR-2000型双光能骨密度仪检测BMD值。

3 结果

3.1 一般状况 模型复制期间，大鼠拱背、毛色晦暗、食量下降、脾气暴躁、小便多，考虑是维甲酸及氢化可的松的不良反应，大鼠灌胃后死亡1只，尸体解剖后考虑灌胃不当，药液灌入气管致死。给药后，不同剂量加味阳和汤组及阳性对照组的大鼠乏力、静卧、小便多等肾阳虚表现得到明显改善，活动增加，毛发渐光泽，食量及体质量均有不同程度的上升。

3.2 各组大鼠股骨BMD比较 与空白对照组比较，模型组大鼠股骨BMD显著降低，差异有统计学意义(P<0.05)；与模型组比较，加味阳和汤中、高剂量组和阳性对照组BMD显著增加，差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。

3.3 各组大鼠血清ALP、TRAP水平比较 与空白对照组比较，模型组大鼠血清ALP和TRAP活性均明显升高，差异有统计学意义(P<0.05)；与模型组比较，各给药组大鼠血清ALP、TRAP活性均显著降低，差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。

3.4 各组大鼠血清Mg、Fe、Zn水平比较 与空白对照组比较，模型组大鼠血清Mg、Fe、Zn水平均显著降低，差异有统计学意义(P<0.05)；与模型组比较，各给药组血清Fe、Zn水平均显著升高，差异有统计学意义(P<0.05)，血清Mg水平的差异无统计学意义(P>0.05)；且加味阳和汤升高血清Mg、Fe、Zn水平呈现剂量依赖性。见表2。

表1 各组大鼠股骨BMD，血清ALP、TRAP活性比较

注：与空白对照组比较，*P<0.05；与模型组比较，#P<0.05

表2 各组大鼠血清Mg、Fe、Zn水平比较

注：与空白对照组比较，*P<0.05；与模型组比较，#P<0.05

4 讨论

OP是以骨量下降为主要特征的代谢性骨病，发病率高，多集中于50岁以上的中老年人，严重影响老年人的生活质量。西医针对OP的治疗相当局限，主要以降钙素、双膦酸盐、氟化物等治疗为主，而这些药物都具有一定的不良反应[4]。中医称OP为“骨痿”。肾主藏精，主骨生髓，肾阳虚是引起OP的主要原因，血瘀次之，故中医治疗重补肝肾、温阳通经络。方中君药鹿角胶、熟地黄补髓强骨补肝肾；臣药麻黄、白芥子温阳通络；甘草调和诸药。该方有温补肾阳、散寒通络之功，能通督脉而补阳，主治肾中阳虚、血络瘀阻之骨痿。此外，现代研究表明，鹿角胶有减少骨胶原分解，抑制骨吸收的作用[5]。

维甲酸诱导OP模型操作简便，时间短，成功率高，在复制OP动物模型中被普遍采用。且该模型会出现全身皮毛卷曲、无光泽、懒动、少食的情况，按中医理论，有肾阳虚表现，可用于复制OP肾阳虚模型。

BMD是临床诊断OP的金标准[6]。模型组大鼠股骨BMD显著低于空白对照组，有神疲、乏力、静卧、小便多等肾阳虚表现，说明模型复制成功。各给药组大鼠股骨BMD均高于模型组，且与加味阳和汤的浓度呈剂量依赖性，说明各给药组对大鼠OP有治疗作用，高剂量加味阳和汤改善大鼠股骨BMD效果最明显。

ALP主要由成骨细胞合成，是骨形成的生化标志物，反映成骨细胞的活性；TRAP主要由破骨细胞分泌，是骨吸收的生化标志物，反映破骨细胞的活性[7-9]。模型组ALP、TRAP显著高于正常对照组，可佐证维甲酸所致骨质疏松为高转换型骨质疏松，骨形成及骨吸收活动加强，但骨吸收速度远高于骨形成，骨量丢失，形成OP[10-11]。各给药组大鼠血清ALP均高于空白对照组，说明各给药组均可不同程度地促进骨形成。各给药组大鼠血清TRAP活性均降低，说明各给药组的骨吸收被不同程度地抑制。

微量元素在人体中含量极少，但在抗病、防癌等方面作用巨大，与人的健康息息相关，维持人体正常的生理活动[12-13]。不同浓度的加味阳和汤对血清Mg、Fe、Zn等微量元素均具有上调作用，可引起矿物质的沉积，增加骨密度，抗骨质疏松。

综上所述，不同剂量加味阳和汤组给药后，大鼠乏力、静卧、小便多等肾阳虚表现得到明显改善，大鼠股骨BMD及血清微量元素均有不同程度的上升，说明加味阳和汤对OP的防治作用与其补肝肾、温阳通经络的功效密不可分。加味阳和汤能改善维甲酸、氢化可的松所致的肾阳虚型OP模型鼠股骨BMD，促进骨形成，抑制骨吸收，引起矿物质的沉积，发挥抗骨质疏松的作用。