黄艳玲 任昊天

摘  要：研究酱油种类及添加量对牛肱二头肌的嫩化作用。将3 种质量浓度15 g/100 mL的酱油溶液与3 g /100 mL的食盐溶液按不同的比例混合，配制9 组腌制液，并以3 g/100 mL的食盐溶液作为对照组（记为C0），按肉液比为1∶4（m/V）将牛肱二头肌肉块（2.5 cm×2.5 cm×2.5 cm）腌制72 h（4 ℃），分析酱油种类及添加量对肉样pH值、剪切力、胶原蛋白含量、肌节长度及肌原纤维碎裂指数（myofibrillar fragmentation index，MFI）等指标的影响。结果表明：酱油腌制会降低肉样的pH值（P<0.05），但对肉样的持水力和总胶原蛋白含量无显著影响（P>0.05）;酱油含量高的腌制液具有更低的pH值，使肉样的可溶性胶原蛋白含量及MFI变大、肌节长度变短，进而提高肉的嫩度;当腌制液中的酱油比例较高时，肉样的嫩度与多汁性感官评分更高，总体可接受度更好。在3 种酱油中，低pH值酱油对牛肱二头肌的嫩化效果更好。

关键词：牛肱二头肌;酱油;腌制;嫩度

中图分类号：TS251.1                                        文献标志码：A 文章编号：1001-8123（2019）02-0046-06

Abstract： This experiment aims to study the effect of type and concentration of soy sauce on the tenderization of bovine biceps brachii muscle. Nine marinades were prepared by blending one of three types of soy sauce （15 g/100 mL） with salt solution （3 g/100 mL） at different ratios. Salt solution was used as a control. Muscle samples were cut into cubes 2.5 cm ×2.5 cm × 2.5 cm and marinated for 72 h at 4 ℃. The effect of type and concentration of soy sauce on pH value， shear force， collagen content， sarcomere length and myofibril fragmentation index （MFI） were analyzed. The results showed that marination with soy sauce reduced the pH value （P < 0.05）， but had no effect on the water-holding capacity or total collagen content （P > 0.05）. The marinade with higher soy sauce content resulted in lower pH value， higher soluble collagen content， higher MFI， shorter sarcomere length and consequently improved meat tenderness. Better tenderness， higher sensory scores for juiciness and better overall consumer acceptance were obtained in a higher proportion of soy sauce in the marinades. Among three types of soy sauce， low-pH soy sauce was better at tenderizing bovine biceps brachii.

牛肱二頭肌富含胶原蛋白，与其他部位相比肉质较硬、嫩度较差[1-2]。肉的嫩度是影响口感的最重要因素之一，影响肉嫩度的因素有很多，包括极限pH值[3]、胴体的冷却温度[4]以及胶原组织的含量和溶解度[5-6]。目前，国内外用于改善肉嫩度最常用的方法有酶法、机械法和化学法，这些嫩化方法不会改变肉的原有风味。而日常工艺中的腌制可以在改变肉风味的同时起到嫩化作用。Oreskovich[7]、Whipple[8]等发现腌制液中的盐类及有机酸类可以增强肉的嫩度，其嫩化机理存在3 种可能：首先是pH值对肌肉蛋白溶解度的影响，导致肌肉或结缔组织的肿胀[9];其次是腌制液中添加的钙盐影响肌肉组织的“钙泵”或磷酸盐以提高肌肉持水能力使肉变软[8];最后是腌制液中可能含有有助于肌肉蛋白水解的酶[10]。

酱油以豆、麦、麸皮和食盐为原料酿造而成，是我国的传统调味品。根据国标可分为酿造酱油（GB 18186—2000《酿造酱油》）和配制酱油（SB 10336—2000《配制酱油》），根据颜色可分为生抽和老抽，根据氨基酸态氮的含量又可分为特级、一级、二级和三级。酱油中含有大量的盐、游离氨基酸、碳水化合物、肽、有机酸、矿物质以及酯类、醇类和醛酮类等呈味物质。Choi[11]、Lee[12]等的研究表明，酱油在发酵过程中会生成大量的有机酸，包括乙酸、乳酸、琥珀酸和焦谷氨酸等。Kim等[13]的研究表明，韩国的酿造酱油对肉具有一定的嫩化作用，并和酱油的发酵过程有关。虽然已知酱油对肉具有嫩化作用，但关于国内酱油对肉品嫩化特性影响的研究报道很少。为研究我国酱油对肉嫩化特性的影响，选取3 种不同品牌的特级生抽酿造酱油，分别从肉样pH值、剪切力、胶原蛋白含量、肌节长度及肌原纤维碎裂指数（myofibrillar fragmentation index，MFI）等指标探究酱油对牛肱二头肌的嫩化作用，比较3 种酱油添加水平不同时对肉的嫩化效果。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

牛肱二头肌（淘汰黑白花奶牛，6 岁龄，宰后56 h）;味极鲜特级生抽酿造酱油（X）、美味鲜特级生抽酿造酱油（Y）、一品鲜特级生抽酿造酱油（Z）（X、Y、Z分别代表不同品牌） 新玛特超市。

氯化钠、氯化钾（分析纯） 天津市鼎盛鑫化工有限公司;盐酸、戊二醛、K2HPO4、乙二醇双（2-氨基乙基醚）四乙酸（glycol-bis-（2-aminoethylether）-N，N，N，N-tetraacetic acid，EGTA）、MgCl2、NaN3（优级纯） 美国Sigma公司。

1.2 仪器与设备

M200 PRO多功能酶标仪 瑞士Tecan公司;pH STAR直测仪 德国Matthaus公司;KP-21C求积仪 日本Koizumi公司;TA-XT2i质构仪 英国Smsta公司;specord 210 plus紫外分光光度计、移液枪 德国Eppendorf公司;PS-1064-10氦氖激光衍射器 美国Photonics Industries公司;96 孔板、MAK008羟脯氨酸测定试剂盒 美国Sigma公司。

1.3 方法

1.3.1 样品预处理及分组

剔除肱二头肌表面多余筋膜与脂肪，垂直于肌纤维方向切片（厚度约为2.5 cm），然后从每片肉的中心切出4 个2.5 cm见方的肉块（尽量保证每块肉上肉眼可见的结缔组织含量接近），每个肉块质量约17 g，一共切出240 个小肉块，随机分配给1 个对照组和9 个处理组（每组24 块）。

腌制液的配制：根据酱油标签上的钠含量计算酱油的盐含量，用pH计测量酱油的pH值。X酱油的盐含量为20.10%，pH值为4.98;Y酱油的盐含量为19.81%，pH值为5.12;Z酱油的盐含量为19.92%，pH值为5.06。为了控制酱油在腌制液中的添加量（腌制液的盐含量需维持在3%），需要将3 种酱油稀释到质量浓度15 g/100 mL后再與3 g/100 mL的食盐溶液按不同比例进行混配分组，分为1 个对照组和9 个处理组，一共10 组，腌制液配比及分组如表1所示。

1.3.2 pH值测定

1.3.3 持水力测定

参照Grau等[14]的测定方法。称取300 mg肉样置于Whatman No.2滤纸的中心，在36 kg/cm2的力下压制3 min。使用求积仪测量水圈和肉饼圈的面积，按照公式（1）计算持水力（water holding capacity，WHC）。

1.3.4 剪切力测定

将肉样放入自制聚乙烯袋中，80 ℃水浴加热，待中心温度达到80 ℃时保持30 min，然后取出冷却至室温。用直径1 cm的中空取样器沿肌纤维方向取样，使用TA-XT2i质构分析仪，选择附件TA.XTC测定剪切力，测定速率设定为2 mm/s。

1.3.5 胶原蛋白含量测定

根据Christensen等[15]的方法测定总胶原蛋白含量及可溶性胶原蛋白含量。为测定总胶原蛋白含量，将取自每个肌肉中心的1 g样品在10 mL蒸馏水中均质，然后加入10 mL 37%盐酸，混匀;将其在120 ℃条件下温育3 h，以确保蛋白质完全水解;水解后，使用Whatman 1号滤纸过滤样品以除去颗粒;将来自每个样品的10 μL滤液转移到96孔微量培养板中，在60 ℃条件下蒸发过夜。

可溶性胶原蛋白含量测定：从总胶原蛋白含量相同的初始样品中取第2个1 g样品，将其置于10 mL 0.3%氯化钠溶液中，并在90 ℃条件下温育2 h;将样品在9 000～10 000 r/min条件下均质约30 s，然后在室温条件下4 500×g离心12 min;用移液枪取500 μL上清液，加入500 μL 37%盐酸，混匀，在120 ℃条件下温育3 h，再将其转移至96孔微量培养板，并在60 ℃条件下蒸发过夜。

一旦孔中的内容物蒸发，使用羟脯氨酸测定试剂盒测定每个孔的羟脯氨酸含量，使用酶标仪测定560 nm波长处的吸光度。使用标准曲线将该吸光度转换为羟脯氨酸含量，乘以7.14得到胶原蛋白含量。

1.3.6 肌节长度测定

参照Voyle[16]的方法。取1～2 g肉样，放入2%戊二醛溶液中浸泡30 min，用尖头镊子撕开肉样肌纤维，置于玻璃载片上，然后使用氦氖激光衍射器，通过光学衍射测量。按照公式（2）计算肌节长度。

1.3.7 MFI测定

参照李晶晶[17]的方法，测定肉样的MFI。取待测牛肉样品4 g，去除脂肪和结缔组织后放入100 mL离心管中，加40 mL预冷（2 ℃）的MFI缓冲液（含100 mmol/L KCl、11.2 mmol/L K2HPO4、8.8 mmol/L KH2PO4、1 mmol/L EGTA、1 mmol/L MgCl2及1 mmol/L NaN3），于冰浴中均质30 s（10 000 r/min）冷却20 s，重复3 次;均质后在2 ℃、1 000×g条件下离心15 min，弃去上清液，加入5 倍体积的MFI缓冲液将沉淀悬浮，悬浮液用18 目聚乙烯滤网过滤，除去结缔组织，滤液利用Bradford法测定蛋白浓度;将悬浮液的质量浓度调整到0.5 mg/mL，然后在540 nm波长处测定其吸光度（A540 nm），按照公式（3）计算MFI。

1.3.8 感官评定

先将各组腌制完成的肉样取出3 块，置于沸水浴中3 min焯掉血沫，然后分别置于（82±2） ℃水浴中煮制90 min;冷却至室温（20 ℃）后，由15 名感官评定人员（6 名男性，9 名女性）对肉样的嫩度、多汁性、风味及综合评分进行10 分制评定。肉样的感官评定标准如表2所示。

1.4 数据处理

每个指标测定3 个平行样，每个平行样重复测定3 次。采用SPSS 20.0软件对实验数据进行处理和分析，包括方差分析（analysis of variance，ANOVA）和Ducans显著性分析。

2 结果与分析

2.1 酱油种类及添加量对牛肱二头肌pH值和WHC的影响

由表3可知：对照组与腌制组肉样的WHC无显著差异（P>0.05），这可能与腌制液的盐含量相同有关（各组腌制液的食盐质量浓度均控制在3 g/100 mL）;而肉样的pH值受酱油种类及添加量的影响。由于酱油发酵过程中有机酸的形成，导致酱油具有较低的pH值。经过72 h的腌制后，肉样pH值的主要贡献者是腌制液而不是肉本身。因此，肉样pH值随酱油添加量的增加而显著降低（P<0.05），在同一添加比例条件下，X组肉样的pH值显著低于Y组与Z组（P<0.05），其中Y组肉样pH值最高，这是由于自然发酵是个不可控的过程，生成有机酸的量与种类也不可控[9]，因此3 种酱油pH值的差异较大（X：4.98、Y：5.12、Z：5.06），导致各组腌制液的pH值具有显著差异。

肉的pH值是影响肉嫩度的重要因素，pH值为肌肉蛋白的等电点（5.02）时，肽键间的静电结合与氢键结合增强，蛋白网状结构缩紧，肉的嫩度变差;只要pH值高于或低于等电点，蛋白质的实效电荷增加，增大肽键间的排斥力，肉嫩度增加[18]。Oreskovich等[7]的研究表明，腌制液的pH值与肉的WHC有直接影响，pH值高于或低于等电点时，腌制肉内保留大量的水分，导致肉的嫩度增加。然而，本研究中所有肉样的pH值均高于等电点，均具有较好的持水能力，WHC的平均值也随pH值的增加具有逐渐升高的趋势，但在统计学上无显著差异。

2.2 酱油种类及添加量对牛肱二头肌剪切力的影响

由表4可知：随着添加X、Y、Z 3 种酱油的腌制液中酱油含量的增加，肉样的剪切力显著降低（P<0.05），肉质更嫩;与对照组相比，X1、Y1、Z1组肉样剪切力的平均值更低，但无统计学差异（P>0.05），而X2、Y2、Z2和X3、Y3、Z3组肉样的剪切力显著降低

（P<0.05）。这与Aktas[19]、Andrés-Bello[20]、Decker[21]等的研究结果一致，即当pH值远离蛋白质等电点时，腌制液的pH值越低，肉的剪切力越低。此外，X2和Z2组肉样的剪切力显著低于Y2组，X3组肉样的剪切力显著低于Y3组，说明当腌制液中酱油的占比升高后，在同一酱油添加水平下，酱油品牌对肉样剪切力具有显著影响（P<0.05），其中使用X酱油配制的腌制液对肱二头肌的嫩化作用最好。

2.3 酱油种类及添加量对牛肱二头肌胶原蛋白含量的影响

胶原蛋白是一种重要的肌肉组织成分，在维持肌肉结构、柔韧性、强度和肌肉质地等方面起着重要作用[6，22]。有研究表明，胶原蛋白含量与肉的嫩度呈负相关，而可溶性胶原蛋白含量与肉的嫩度呈正相关[23-24]。

2.4 酱油种类及添加量对牛肱二头肌肌节长度的影响

肌节长度是反映嫩度的指标之一。Hwang[26]、Marcos[27]等指出，当肉成熟后肌原纤维蛋白水解缓慢，肌节长度是肉剪切力的重要决定因素，肌节长度越短，剪切力越小，肉的嫩度越好。

2.5 酱油种类及添加量对牛肱二头肌MFI的影响

2.6 酱油种类及添加量对牛肱二头肌感官评分的影响

由表5可知，腌制液中的酱油种类及添加量对肉样的嫩度、多汁性及综合评分具有显著影响（P<0.05）。腌制液中添加酱油的9 组肉样的风味评分均显著高于对照组（P<0.05），但各组之间无显著差异（P>0.05），没有出现腌制液中酱油含量过高可能会对风味产生负面影响的结果，这可能与实验采用的煮制烹饪方式有关。肉样嫩度的评分情况与2.2节中剪切力的变化情况在一定程度上相对应，当腌制液中酱油稀释液的占比超过40%时，肉样的嫩度评分显著高于对照组、X1、Y1和Z1组（P<0.05），其中X3组肉样的嫩度评分最高，平均值達9.48 分，说明酱油对牛肉的嫩化作用不仅体现在硬性指标上，在人的主观感受上也会有较为明显的察觉。值得注意的是，2.1节的结果表明，酱油种类及添加量对肉样的WHC无显著影响（P>0.05），而肉样经过煮制之后，酱油的种类及添加量对肉样的多汁性具有显著影响（P<0.05），腌制液中酱油含量的增加可显著提高肉样的多汁性，而且在X、Y、Z 3 种酱油中X酱油的积极作用更明显。此外，根据综合评分可知，X3、Z3 2 组腌制肉样的总体可接受度更好。

3 结 论

由于各组腌制液的pH值具有显著差异，导致肉样在浸泡72 h后的pH值同样差异显著（P<0.05）。在酱油种类不变的条件下，随着腌制液中的酱油添加量的增加，肉样的pH值显著降低，但对WHC和总胶原蛋白含量无显著影响（P>0.05）;随着pH值的降低，肉样的可溶性蛋白含量显著增加、肌节长度显著变短、MFI显著升高，进而使肉样的剪切力显著降低，肉质更嫩;而在X、Y、Z 3 种酱油中X酱油的pH值最低（4.98），因此在相同添加量条件下，使用含X酱油腌制液腌制出的肉样具有更好的嫩度，肉样嫩度和多汁性的感官评分更高，但pH值与肌节长度间的相互作用还需深入研究。

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