山东第一医科大学(山东省医学科学院)，山东 泰安 271016

泰山紫草(又称硬紫草)为紫草科植物紫草LithospermumerythrorhizonSieb.etZuce的干燥根[1]。据《神农本草经》记载，紫草味苦、性寒，具有凉血、活血、清热、解毒、消炎和透疹的功能，紫草中主要有效成分为羟基萘醌类，具有抗菌、抗肿瘤、抗病毒、抗炎、抗过敏、保肝降酶等作用[2]。《中国药典》记录是以紫草素、β，β-二甲基丙烯酰紫草素作为指标性成分来对紫草药材饮片进行质量控制[3]。紫草在我国的各地均有分布，主要产地包括山东、新疆、内蒙古、甘肃等，查阅文献发现对泰山紫草成分含量研究的较少，多是HPLC法分析新疆紫草中萘醌类成分的报道[4-5]。而泰山紫草药材作为泰山的名药之一，同样具有很高的研究价值。本实验通过建立高效液相法，同时对泰安产地的紫草药材中5种萘醌类成分的含量进行测定，从而为紫草药材资源的开发提供依据，同时为泰山紫草药材药用价值的研究提供依据。

1 仪器与试药

1.1 仪器

Waters 高效液相色谱仪，Symmetry C18 色谱柱(4.6 mm×250 mm,5 μm)，电子天平(上海奥豪斯仪器有限公司)，KQ-500E型超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)，0.45 μm微孔滤膜。

1.2 试药

5种对照品均购自上海源叶生物技术有限公司，纯度均≥98%，左旋紫草素(批号Z-017-150525)、乙酰紫草素(批号R21J7F16576)、去氧紫草素(批号Z11D6H7417)、异丁酰紫草素(批号T21J7Z9356)、β，β′-二甲基丙烯酰阿卡宁(批号 P03A6F2066)。泰山紫草(泰安市四大名药开发有限公司)，乙腈、甲醇为色谱纯(美国天地)，纯净水。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：Symmetry C18 (4.6 mm×250 mm,5 μm)；流动相：乙腈-水(70∶30)；检测波长：516 nm；柱温：30℃；流速：1.0 mL·min-1；进样量：20 μL。

2.2 溶液的制备

2.2.1对照品的制备 分别称取左旋紫草素、乙酰紫草素、去氧紫草素、异丁酰紫草素、β，β′-二甲基丙烯酰阿卡宁各对照品适量，用甲醇溶解并制成质量浓度分别为2.2、8.8、2.0、8.5、3.0 mg·mL-1的对照品贮备液。再精密移取各对照品1 mL于10 mL量瓶中，用甲醇稀释到刻度，摇匀，即得混合对照品溶液，各对照品质量浓度依次为0.22、0.88、0.20、0.85、0.30 mg·mL-1。

2.2.2供试品的制备 称取泰山紫草粉末约1 g，置具塞锥形瓶中，精密加入流动相40 mL，称定重量，超声处理(250 W，33 kHz)40 min，放冷，称重，用流动相补足减失的重量，摇匀，提取液过0.45 μm滤膜，取续滤液作为供试品溶液，20 μL进样。

2.3 专属性考察

取空白溶液、混合对照品溶液、供试品溶液适量，按“2.1”项下色谱条件进样，记录色谱，详见图1。由图1可见，空白溶液色谱在对照品色谱相应位置处无吸收峰，表明在该试验条件下专属性较好。

图1 专属性考察

2.4 线性关系考察

分别精密吸取“2.2.1”项下混合对照品贮备液0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL，置于10 mL量瓶中，溶剂稀释至刻度，摇匀，即得系列质量浓度的混合对照品溶液。按“2.1”项下色谱条件进样，记录各成分峰面积。以对照品质量浓度(x，μg/mL)对峰面积积分值(y)进行线性回归，得到各化合物的回归方程和线性范围，结果见表1。

2.5 精密度试验

吸取“2.2.1”项下混合对照品溶液，按照上述色谱条件进样，记录各峰面积，重复6次，计算左旋紫草素、乙酰紫草素、去氧紫草素、异丁酰紫草素、β，β′-二甲基丙烯酰阿卡宁的峰面积RSD(n=6)分别为 1.28%、2.06%、1.80%、1.93%、2.39%，结果表明仪器精密度符合要求。

2.6 重复性试验

称取同一批次的泰山紫草粉末(约1 g)6份，照“2.2.2”项下方法制备成供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件进行测定，分别计算样品溶液中左旋紫草素、乙酰紫草素、去氧紫草素、异丁酰紫草素、β，β′-二甲基丙烯酰阿卡宁峰面积的RSD(n=6)分别为1.52%、0.98%、1.31%、2.65%、1.62%，表明该方法重复性良好。

2.7 稳定性试验

照“2.2.2”项下方法制备泰山紫草供试品溶液，分别于 0、2、4、6、8、10、12 h 进行测定，结果计算得左旋紫草素、乙酰紫草素、去氧紫草素、异丁酰紫草素、β，β′-二甲基丙烯酰阿卡宁峰面积RSD(n=6)分别为1.22%、0.82%、0.59%、1.29%、2.08%，均小于3.0%。表明样品溶液在12 h内稳定。

2.8 加样回收率试验

取已知含量的泰山紫草粉末约 0.5 g，6份，精密称定。分别精密加入左旋紫草素对照品(220 μg·mL-1)0.3 mL、乙酰紫草素对照品(880 μg·mL-1)0.6 mL、去氧紫草素对照品(200 μg·mL-1)0.3 mL、异丁酰紫草素对照品(850 μg·mL-1)0.5 mL，β，β′-二甲基丙烯酰阿卡宁对照品(300 μg·mL-1)0.2 mL，按“2.2.2”项下方法制备加样回收供试溶液，进样测定，测定含量，结果见表2。

表1 5种萘醌类成分的线性回归方程

表2 加样回收试验结果

2.9 样品含量测定

取泰山紫草粉末3份，按“2.2.2”项下供试品溶液制备方法制成供试液溶液，照“2.1”项下色谱条件测定，记录各成分峰面积，计算泰山紫草中左旋紫草素、乙酰紫草素、去氧紫草素、异丁酰紫草素、β，β′-二甲基丙烯酰阿卡宁的平均含量分别为0.12、1.03、0.10、0.92、0.15 mg·g-1。

3 讨 论

3.1 提取工艺选择

查阅大量的资料可知一些紫草的提取方法，有超声法、浸渍法、渗漉法、加热回流法等。而紫草中的萘醌类化合物对温度、酸碱度、氧等一些因素比较敏感[3]，这为紫草的提取工艺提出了较为严格的条件。查阅文献可知超声提取方法无需加热、加压，在常温下即可以进行实验。综合考虑多方面因素，最终选择的是超声法提取。

3.2 色谱条件的确定

流动相为乙腈∶水=60∶40时，萘醌类成分不出峰；乙腈∶水=80∶20时，萘醌类成分均出峰，但有些萘醌类成分不能完全分开；乙腈∶水=70∶30时，萘醌类成分均出峰，且分离效果较好，基线稳定，因此，流动相选择乙腈∶水=70∶30。选择测定波长时，萘醌类成分在516 nm下分离良好且无干扰，故测定波长确定为516 nm。