沈丹丹 ，许 娟 ，姜学美 ，肖 波 △

（1.重庆市食品药品检验检测研究院，重庆 401121； 2.重庆市药物过程与质量控制工程技术研究中心，重庆401121； 3.重庆仁泽医药科技有限公司，重庆 400021）

环索奈德是由ALTANA Pharma AG开发的适用于支气管哮喘和过敏性鼻炎的皮质类固醇，为前体药物，鼻内给药的环索奈德被鼻黏膜内的酯酶水解成具有生物学活性的代谢产物-去异丁酰基环索奈德［1-7］。由Nycomed公司开发的水性鼻喷雾剂在加拿大、阿根廷、巴西、墨西哥、香港、韩国、马来西亚上市，由Sunovion公司在美国上市，商品名Omnaris，用于治疗成人和12岁以上儿童季节性和常年性过敏性鼻炎所引起的鼻部症状。目前，国内尚无环索奈德鼻喷雾剂上市。根据Omnaris美国药品说明书公布［8］的本品处方信息，含有防腐剂山梨酸钾和防腐增效剂依地酸二钠，其用量分别为0.12% 和 0.01% （w／w），根据美国食品药物管理局（FDA）药品评价与研究中心（CDER）的行业指南文件《鼻腔喷雾剂，吸入溶液、混悬液，及喷雾药品-化学、制造及控制文件》（CMC），若处方中使用了防腐剂、抗氧剂、螯合剂或其他稳定剂（如苯扎氯铵、苯乙醇、依地酸盐），应对这些成分进行专属性含量测定，并制订验收标准。本研究中建立了一种同时测定山梨酸钾和依地酸二钠含量的色谱方法，逆向解析产品中防腐剂用量，为本品的处方工艺研究提供依据，同时保证产品的安全性、有效性及可控性。现报道如下。

1 仪器与试药

1.1 仪器

Agilent 1260型高效液相色谱仪（美国Agilent公司）；K51502653型电子天平（德国赛多利斯＜中国＞有限公司）。

1.2 试药

山梨酸钾对照品（中国食品药品检定研究院，批号为 101075-201602，含量为 99.7%）；依地酸二钠（南京化学试剂股份有限公司，批号为20161104，含量为99.0% ）；环索奈德鼻喷雾剂（商品名 Omnaris，Sunovion制药有限公司，批号为183844，规格为每瓶12.5 g）；硼砂、硫酸铜为分析纯，乙腈为色谱纯。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：Inertsil® ODS-3 C18柱（250 mm ×4.6 mm，5 μm）；流动相：乙腈 -0.02 mol／L 硼砂溶液（10 ∶90）；检测波长：288 nm；柱温：30 ℃；流速：1.0 mL ／min；进样量：20 μL。

图1 专属性试验高效液相色谱图

2.2 溶液制备

取样品2.0 g，精密称定，置25 mL容量瓶中，加0.1%CuSO4溶液 0.5 mL，用水稀释至刻度，摇匀，离心，用0.45 μm微孔滤膜滤过，取续滤液，作为供试品溶液。另取依地酸二钠对照品约40 mg、山梨酸钾对照品约481 mg，精密称定，置500 mL容量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀，精密吸取 5.0 mL，加 0.1%CuSO4溶液1 mL，再用水稀释至50 mL，摇匀，即得每1 mL约含依地酸二钠8 μg和山梨酸钾96 μg的溶液，作为对照品溶液。

2.3 方法学考察

专属性试验：按照处方工艺配制混合辅料，精密量取辅料适量，按2.2项下供试品溶液制备方法配制辅料空白溶液；吸取 0.1%CuSO4溶液 0.5 mL，用水稀释至25 mL，摇匀，即得空白溶剂。精密量取续滤液20 μL注入液相色谱仪，测定，记录色谱图（图1）。在此条件下，空白溶剂、辅料空白溶液不干扰依地酸二钠和山梨酸钾的测试，依地酸二钠和山梨酸钾之间的分离度远大于1.5，理论板数均大于3 000，专属性良好。

精密度试验：精密吸取对照品溶液20 μL，平行6针，注入液相色谱仪，记录色谱图。结果依地酸二钠和山梨酸钾峰面积的RSD分别为1.1%和1.4%（n＝6）。

线性关系考察：取依地酸二钠对照品约0.04 g和山梨酸钾约0.48 g，精密称定，加水溶解并稀释至同一500 mL容量瓶中，摇匀，作为依地酸二钠与山梨酸钾对照品贮备液。精密吸取依地酸二钠与山梨酸钾对照品贮备液 2，3，4，5，6，7，8 mL，加 0.1%CuSO4溶液 1 mL，再用水稀释至50 mL，摇匀，即得系列对照品溶液。精密吸取对照品溶液系列各20 μL，分别注入液相色谱仪，记录色谱图。以质量浓度（C）为横坐标、峰面积（A）为纵坐标绘制标准曲线，得回归方程，依地酸二钠为A＝7.675 6C+0.253 6（r＝0.999 9），山 梨 酸 钾 为A＝5.713 6C+20.477 9（r＝0.999 8）。结果表明，依地酸二钠进样质量浓度线性范围是 3.209 6 ～12.838 4 μg／mL，山梨酸钾进样质量浓度线性范围是 38.46 ～153.82 μg／mL。

稳定性试验：取2.2项下同一供试品溶液，分别于0，6，12，18，24 h 时吸取 20 μL，注入液相色谱仪，测定。结果记录色谱图，依地酸二钠和山梨酸钾峰面积的RSD分别为 0.91%和 0.48% （n＝5），表明供试品溶液在24 h内稳定性好。

重复性试验：取样品6份，按2.2项下方法制备供试品溶液，依法进样测定。结果依地酸二钠与山梨酸钾的平均含量分别为0.010 1%和0.119 9%，RSD分别为 0.7%和 1.1% （n＝6）。

定量限与检测限确定：取依地酸二钠和山梨酸钾对照品适量，精密称定，按2.2项下方法制备每1 mL中约含依地酸二钠8 μg和山梨酸钾96 μg的对照品溶液。精密量取1.0 mL，用水逐级稀释成系列浓度，吸取20 μL注入液相色谱仪，记录色谱图。以信噪比（S／N）为3∶1计算检测限，以S／N为10∶1计算定量限。结果依地酸二钠和山梨酸钾检测限分别为7.2 ng和5.0 ng，定量限分别为 24.0 ng 和 16.4 ng。

加样回收试验：精密称取依地酸二钠对照品约0.04 g和山梨酸钾约0.48 g，加水溶解并稀释至同一500 mL容量瓶内，摇匀，作为依地酸二钠与山梨酸钾对照品贮备液。精密称取样品辅料空白约2 g，平行9份，分别置25 mL容量瓶中，3份加入依地酸二钠和山梨酸钾对照品贮备液1.0 mL，3份加入依地酸二钠和山梨酸钾对照品贮备液2.5 mL，3份加入依地酸二钠和山梨酸钾对照品贮备液 4.0 mL，再分别加 0.1%CuSO4溶液0.5 mL，用水稀释至25 mL，摇匀，离心，用微孔滤膜滤过，弃去前滤液，取续滤液作为供试品溶液。精密吸取20 μL注入液相色谱仪，测定记录色谱图，计算回收率。结果见表1。

2.4 耐用性试验

色谱柱：选用AgilentEcplisePlus-C18柱及Inertsil®ODS-3 C18柱对供试品溶液进行测定，其他条件保持不变。结果不同种类的色谱柱对分离度无明显影响，依地酸二钠与山梨酸钾平均含量分别为0.010 0%和0.119 4%，表明所选色谱柱耐用性强。

流动相比例：选用色谱柱Inertsil® ODS-3 C18柱，改变流动相比例，其他条件保持不变，取2.2项下供试品溶液20 μL注入液相色谱仪，测定。结果乙腈在±5%变化范围内，分离度均大于2.0，表明流动相比例耐用性强。

表1 加样回收试验结果（n＝9）

流速：将流速分别设定为 0.8，1.0，1.2 mL ／min，其他条件保持不变，取2.2项下供试品溶液20 μL注入液相色谱仪，测定。结果流速在 0.8～1.2 mL ／min 范围内变化，分离度均大于2.0，表明流速耐用性强。

0.1%CuSO4溶液加入量：取本品，分别将供试品溶液配制过程中的0.1%CuSO4溶液的加入量设定为0.25，0.50，1.00 mL，其他条件不变，按拟订色谱条件，取20 μL注入液相色谱仪，测定。结果依地酸二钠平均含量分别为 0.010 1%，0.010 1%，0.010 0%，RSD为0.6% （n＝3）；山梨酸钾平均含量为 0.1206%，0.1205%，0.119 7% ，RSD为 0.4% （n＝3）。可见，加入 0.25～1.00 mL的0.1%CuSO4溶液均能完全络合样品中的依地酸二钠，对测试结果无影响。

柱温：将柱温分别设定为20，25，30℃，其他条件保持不变，取2.2项下供试品溶液20 μL注入液相色谱仪，测定。结果柱温在20～30℃范围内变化，分离度均大于2.0，表明柱温耐用性强。

2.5 影响因素试验

高温：取样品分为正立和倒立放置，分别于40℃和60℃放置10 d，于第5天和第10天取样，作为高温40℃和60℃的破坏样品。

高湿：取样品分为正立和倒立放置，分别于（92.5±5）%相对湿度下放置10 d，于第5天和第10天取样，作为高湿破坏样品。

光照：取样品去除铝塑外包装（为棕色瓶包装），分为正立和倒立放置，于（4 500±500）lx光照箱中放置10 d，于第5天和第10天取样。另取本品，将喷雾剂药液转移出棕色瓶，装入无色透明的玻璃容器内，横放于（4 500±500）lx光照箱中，于第5天和第10天取样。以上2种条件下的样品均作为光照破坏样品。

表2 高温试验测定结果（%）

表3 光照试验测定结果（%）

将破坏后的样品按2.2项下方法制备供试品溶液，在拟订色谱条件下进样分析，记录色谱图。与未经破坏的防腐剂含量测定结果比较，详见表2至表4。结果表明，与0 d比较，高温及高湿条件下，依地酸二钠与山梨酸钾含量均无显著变化，质量稳定，说明对高温及高湿不敏感，包装密封性好；在无色透明玻璃容器内进行的光照试验中，防腐剂山梨酸钾含量降低，说明样品对光敏感，应采用避光包装；光照试验中，依地酸二钠与山梨酸钾含量无显著变化，质量稳定，说明棕色瓶避光包装有利于本品的稳定。

表4 高湿试验测定结果（%）

3 讨论

3.1 流动相选择

流动相的筛选是参照文献［9］中288 nm波长测定。通过紫外光谱（UV）扫描可知，依地酸二钠UV吸收很弱，无法测试，与铜络合后生成乙二胺乙酸铜钠（EDTA-Cu），在200～300 nm波长范围内均有较强吸收。山梨酸钾在255 nm波长有最大吸收，吸收很强，在288 nm波长处有一定吸收，本研究选择288 nm作为山梨酸钾和依地酸二钠的检测波长。本研究中对0.1%CuSO4溶液的加入量进行了考察，结果表明，在加入0.25 ～1.00 mL 的 0.1%CuSO4溶液均能完全络合样品中的依地酸二钠，对测试结果无影响。本研究建立的色谱条件能同时测定山梨酸钾和依地酸二钠的含量，缩短分析时间，2个主峰均有效洗脱，并与相邻峰分离良好。

3.2 影响因素试验

在高温及高湿条件下，随着时间的增加，山梨酸钾和依地酸二钠含量均无明显变化；在光照条件下，棕色瓶包装的依地酸二钠与山梨酸钾含量无显著变化，质量稳定，将环索奈德鼻喷雾剂药液装入无色透明的玻璃容器内进行光照试验，防腐剂山梨酸钾含量降低，说明本品对光敏感，应采用避光包装。

环索奈德鼻喷雾剂处方中含有防腐剂山梨酸钾和防腐增效剂依地酸二钠，其用量分别为0.12%和0.01%（w／w），本研究建立了专属性的含量测定方法，结果表明国外上市样品中山梨酸钾均在标示量（0.12%，g／g）的90%（0.108% ，w／w）～110%（0.132%，g／g）范围内，依地酸二钠均在标示量（0.01%，g／g）的 90%（0.009%，g／g）～110% （0.011% ，g ／g）范围内。国内企业研发该品种时应加强对处方防腐剂的质量控制，从而使产品处方、质量水平与原研产品达到一致，弥补该品种在国内市场的空白。