戴明珠， 吕圭源， 徐俞悦， 郑 祥， 陈素红,3△

(1. 温州医科大学药学院， 温州 325035； 2. 浙江中医药大学现代中药与健康产品研究所， 杭州 310053； 3. 浙江工业大学长三角绿色制药协同创新中心， 杭州 310014)

先兆流产是指妊娠早期出现少量阴道流血，继而出现下腹痛或腰酸等症状，严重者会因为阴道流血量增多或下腹疼痛加重而发展为流产[1]。先兆流产发病原因较多，可能与遗传、环境、母体因素、内分泌功能和免疫因素等密切相关[2]。近年来，随着生活方式的改变和生存环境的复杂化，先兆流产的发病率逐年上升。研究发现，中医药在整体观念和辨证论治的指导下治疗先兆流产具有明显的特色与优势，其临床疗效确切，不良反应较少[3]。孕康口服液(Yun Kang oral liquid，YK)为已上市中成药，具有固肾健脾、养血安胎之效。基于此，本研究采用肾虚-黄体抑制导致的先兆流产模型，进一步评价孕康口服液的安胎作用，为临床使用提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 试验药物

回音必®孕康口服液(批号16070102)，现开现用，回音必集团浙江齐齐制药有限公司。地屈孕酮片(批号351086)、羟基脲片(批号6C019D05)、米非司酮片(批号160704)，浙江省中医院西药房提供。

1.2 动物

SPF级SD大鼠，雌70只，体重(260±20)g；雄30只，体重(280±20)g。由浙江中医药大学实验动物中心提供，许可证号：SCXK(苏)2013-0003。

1.3 试剂

雌二醇(estradiol，E2)、孕酮(progesterone，P)测试盒，批号均为E20170101A；血栓素B2(thromboxaneB2，TXB2)测试盒，批号均为20160103，均购自上海源叶生物科技有限公司。

1.4 仪器

全自动生化分析仪(TBA-40FR)，日本东芝医疗系统株式会社；酶标仪(Powerwave 340)，美国Bio-TEK公司；多功能自主活动记录仪(YLS-1A)、鼠尾光照测痛仪(YLS-12A)、大小鼠抓力测定仪(YLS-13A)，山东省医学科学院设备供应维修站；红外非接触额温量测器(8877)，北京东方海汇电子技术有限公司。

1.5 模型的建立及处理

将发情前期或发情期的雌鼠与雄鼠进行合笼交配，每笼雌鼠与雄鼠的数量比例为1∶1，以发现白色阴道栓或阴道涂片见大量精子者，记为雌鼠妊娠第1日。将妊娠大鼠随机分为6组：正常对照组(NC)，模型组(MG)，地屈孕酮组(DT，3.02 mg/kg)，孕康口服液低剂量组(YK-L，4 ml/kg)、中剂量组(YK-M，6 ml/kg)、高剂量组(YK-H，9 ml/kg)，每组10只。自妊娠第1日，每日上午各给药组按规定剂量灌予受试药，NC组、MG组给予等体积的纯化水，连续10 d；每天下午灌胃造模，除NC组给予纯化水外，其余各组按450 mg/kg体质量灌胃羟基脲，连续9 d，第10日按4.0 mg/kg体质量灌胃米非司酮，建立肾虚-黄体抑制型先兆流产模型。妊娠第11日，各组腹主动脉取血备用，并摘取卵巢、连胎子宫。

1.6 检测指标

体征：观察大鼠体征及阴道出血状况，每天称量并记录大鼠体重。

一般行为学指标：于妊娠第9日测定大鼠背温、抓力、痛域、自主活动。(1)背温：将红外测量器的测试孔紧贴孕鼠背弓部，当测量仪数值稳定后读数。(2)抓力：抓持大鼠尾根处，待大鼠用力抓住弹性拉力板时及时施力后拉至大鼠放弃拉力板，仪器读出抓力值；(3)痛域：将大鼠身体置于固定器中，使其尾部置于仪器热辐射区，当大鼠尾部迅速甩离热辐射区时仪器自动读数。(4)自主活动：安静漆黑环境下，将大鼠放入自主活动箱中，测定10 min内的总活动次数。

脏器指数测定：妊娠大鼠称重、取血后，处死大鼠，解剖取卵巢、连胎子宫，计算脏器指数=脏器质量/体重×100%。

连胎子宫：(1)连胎子宫整体形态(拍照)：颜色，有无瘀血、粘连，有无丢失胚胎等。(2)胚胎个数：记录胚胎个数。(3)胚胎直径：用直尺测量连续3个胚胎总长，平行测量3次，取平均值。

血清指标：采用酶联免疫吸附试验法检测血清E2、P、TXB2水平。

1.7 统计学处理

2 结果

2.1 孕康口服液对体征及阴道出血症状的影响

NC组大鼠体重增加且呈腹型肥胖，好动，毛色光洁，无脱毛等现象，大小便正常，无阴道出血；MG组形体消瘦、毛色枯黄，颈背部、四肢脱毛明显，小便频数且几近无色，妊娠第5日开始逐渐出现阴道出血现象；YK各剂量组均可改善模型一般体征，减少阴道出血症状，尤其以YK-H组一般体征向NC组靠拢，且无阴道出血症状。

2.2 孕康口服液对体重的影响

与NC组比较，MG组给药第5、7日体重明显降低(P<0.05)，至第9日显著降低(P<0.01)；与MG比较，YK-L组体重第9日明显升高(P<0.05)，YK-M、YK-H组第5、7日体重均明显升高(P<0.05)，至第9日则显著升高(P<0.01)，DT组则差异无显著性(表1)。

GroupNumber of days of pregnancy(d)1579NC270.5±12.9292.3±17.6297.1±20.1308.3±17.8MG274.4±12.0279.4±9.8*281.5±18.4*281.4±20.9**DT272.8±11.7277.9±18.6281.9±18.8288.2±20.2YK-L271.6±18.9283.4±25.9284.0±18.0292.9±17.4#YK-M274.4±8.0295.2±18.8#299.8±15.8#302.1±17.0##YK-H274.3±12.6291.8±15.4#299.6±15.6#301.2±14.9##

NC: Normal control; MG: Model group; DT: Dydrogesterone; YK: Yun Kang oral liquid

*P<0.05,**P<0.01vscontrol group;#P<0.05,##P< 0.01vsmodel group

2.3 孕康口服液对背温、抓力、痛域及自主活动的影响

与NC组比较，MG组背温、抓力、痛域、自主活动次数均显著降低(P<0.05，0.01)；与MG组比较，YK各剂量组背温、抓力均显著升高(P<0.05， 0.01)，YK-M、YK-H组痛域、自主活动次数均明显增多(P<0.05)，DT组则差异无显著性(表2)。

NC: Normal control; MG: Model group; DT: Dydrogesterone; YK: Yun Kang oral liquid

*P<0.05,**P<0.01vscontrol group;#P<0.05,##P< 0.01vsmodel group

2.4 孕康口服液对连胎子宫形态的影响

NC组子宫粗大，均匀如串珠状，呈粉红色或肉色，未见出血或瘀血，解剖后见胚胎完好；MG组子宫呈竹节样改变，宫腔内可见明显瘀血或见坏死胚胎，或胚胎呈黑褐色，或无胚胎仅有胚胎着床点；YK-L组仅部分胚胎丢失或见瘀血，DT组连胎子宫形态较YK-L组状态佳，YK-M、YK-H组连胎子宫形态向正常形态靠拢且优于DT组(图1)。

Fig.1Effects of Yun Kang oral liquid on uterine morphology of kidney deficiency and luteum inhibition rats

A: Normal control B: Model group C: Dydrogesterone

D: YK-L E: YK-L F: YK-H

2.5 孕康口服液对卵巢、连胎子宫指数和胚胎个数、直径的影响

与NC组比，MG组连胎子宫指数、胚胎个数、胚胎直径显著降低(P<0.01)；与MG组比较，YK-M、YK-H组和DT组连胎子宫指数明显升高(P< 0.05)，YK各剂量组和DT组胚胎个数、胚胎直径均显著升高(P<0.05，0.01)，其中YK-H组胚胎个数明显高于YK-L组(P<0.05)；与DT组比较，YK-H组胚胎个数明显升高(P<0.05)。各组间卵巢指数无显著性差异(表3)。

GroupOvarian index(mg/g)Uterine index(mg/g)Number of embryos(number)Embryonic diameter(cm)NC0.83±0.148.26±1.7115.8±1.810.55±0.04MG0.82±0.085.81±1.52**7.5±3.44**0.37±0.14**DT0.83±0.156.81±0.86#12.5±3.21##0.48±0.05#YK-L0.85±0.065.84±0.9112.4±2.59##0.47±0.04#YK-M0.85±0.096.74±0.54#13.9±2.08##0.46±0.05#YK-H0.87±0.106.79±0.85#14.8±2.30##△▲0.50±0.02##

NC: Normal control; MG: Model group; DT: Dydrogesterone; YK:Yun Kang oral liquid

**P<0.01vscontrol group;#P<0.05,##P<0.01vsmodel group;△P<0.05vsdydrogesterone;▲P<0.05vsYK-L

2.6 孕康口服液对血清E2、P、TXB2水平的影响

与NC组比较，MG组血清E2、P、TXB2水平均明显下降(P<0.05)。与MG组比较，YK各剂量组血清E2、P水平均显著上升(P<0.05，0.01)，其中YK-H组血清P水平明显高于YK-L组(P<0.05)；YK-H组血清TXB2水平显著上升(P<0.05)；DT组各指标差异均无显著性(表4)。

GroupE2(pmol/L)P(ng/ml) TXB2(pg/ml)NC20.95±6.725.60±1.93750.56±167.29MG16.36±2.68*4.45±0.52*588.33±186.29*DT14.75±2.014.63±0.31568.33±85.78YK-L18.61±2.04#4.97±0.46#661.67±152.55YK-M19.65±4.07#5.03±0.72#715.00±214.99YK-H20.73±4.29##5.55±0.69##▲803.33±235.60#

NC: Normal control; MG: Model group; DT: Dydrogesterone; YK: Yun Kang oral liquid; E2: Estradiol; P: Progesterone; TXB2: Thromboxane B2

*P<0.05vscontrol group;#P<0.05,##P<0.01vsmodel group;▲P<0.05vsYK-L

3 讨论

先兆流产在中医学上属“滑胎”“胎漏”等范畴，传统中医认为造成先兆流产的主要病因为肾虚。肾虚则冲任不固，无以系胎，胎失所养；肾虚则冲任失调，迫血妄行，血热血海不固，可导致先兆流产[4]。孕康口服液由23味中药组成，其组方与功能主治提示该药具有健脾固肾，养血安胎之功效。本实验通过羟基脲和米非司酮联用制备肾虚-黄体抑制型先兆流产大鼠模型，其中羟基脲可抑制核苷酸的代谢，导致虚损症状[5]；米非司酮则通过发挥拮抗孕酮的作用而起到抗生育的效果[6]，二者联用模拟临床上妊娠早期先兆流产的病理状态。实验表明模型鼠妊娠第5日逐渐产生阴道出血现象，出现了一系列的肾虚症状，表现为形体消瘦、毛色枯黄，颈背部、四肢脱毛明显，并且抓力值下降、背温降低、自主活动减少、痛阈值降低，与临床上肾虚之腰膝酸软、冷疼、懒言少动、毛发不固等症状相吻合；同时模型鼠连胎子宫腔内可见明显瘀血或见坏死胚胎，胚胎个数和直径降低。经孕康口服液干预后，减少了模型鼠的阴道出血症状，并升高背温、抓力值、痛阈值、自主活动次数，明显改善肾虚症状；同时孕康口服液可提高胚胎个数和直径，改善连胎子宫形态，其中YK-H组效果优于DT组。

胚胎着床及继续发育，依赖于复杂的内分泌系统彼此协调，任何一个环节异常均可导致先兆流产，其中黄体功能不全是造成先兆流产最常见的内分泌因素[7-8]。在妊娠早期，黄体功能不全可导致E2、P激素水平下降，使子宫收缩性增加，引发先兆流产[9-10]。孕康口服液中用山药健脾益肾，以菟丝子、续断、桑寄生补肾固胎，以狗脊、补骨脂、杜仲壮腰健肾。研究表明，补肾类中药能够增强黄体功能，提高E2、P激素水平，从而促进胚胎发育，降低流产率[11]。实验表明，YK各剂量组可通过升高血清E2、P激素水平，抑制子宫收缩，维持子宫的静息状态而利于妊娠；此外，YK-H组通过升高血清TXB2水平，以促进血小板聚集及血管收缩，达到止血安胎的作用，这可能与孕康口服液含有苎麻根、黄芩、艾叶等止血类中药有关。

综上所述，孕康口服液可改善肾虚症状，提高胚胎个数，具有明显的补肾安胎作用，其机制可能是升高E2、P水平，抑制子宫收缩，维持子宫安静状态；升高TXB2水平，促进血小板凝聚、血管收缩，预防出血和先兆流产。这为临床上合理应用孕康口服液提供了科学依据。