■陈漪汶 郭奕轩 陈婉滢 朱剑锋 庞 旭 胡文锋*

(1.华南农业大学食品学院，广东广州 510642；2.生物源生物技术（深圳）股份有限公司，广东深圳 518118；3.广州无两生物科技有限公司，广东广州 510640)

预计2030年高收入国家的人均肉类消费量将增 加9%（与2000 年每人每年消费86 kg 肉类对比），而中国的人均肉类消费量则增加50%（与2000 年每人每年消费49 kg肉类对比），为此饲料粮的需求量会增加约48%（高收入国家）和158%（中国）[1]。谷物、高蛋白含量饲料的需求和肉类的消费密切相关，全球人均肉类消费量需求的增大，导致谷物粮食的需求量也随之增加[2]。未来全球的粮食生产与肉食供应将面临巨大的压力。另外，肉类作为蛋白质源除了供应的问题外，还存在着安全问题[3-6]。

霉菌毒素是由曲霉菌属、镰刀菌属、青霉菌属等霉菌产生的有毒次级代谢产物[7-10]。霉菌毒素给人们带来的危害十分巨大。例如，黄曲霉毒素是肝癌的诱因之一[11]；呕吐毒素影响动物的免疫应答[12-13]与肠道功能[14]。针对霉菌毒素的问题，我国、欧盟等国家或地区对食品与饲料中的霉菌毒素做出限量标准。据统计因管理不善发生霉变，全球每年约有25%的农作物遭受霉菌毒素的污染，约有2%的粮食由于霉变而不能食用，造成的直接和间接经济损失达到数百亿美元[15]。

呕吐毒素(Vomitoxin)，又称脱氧雪腐镰刀菌烯醇(DON)，化学名为3α, 7α, 15-三羟基草镰孢菌-9-烯-8-酮，属单端孢霉烯族化合物[16]，主要由禾谷镰刀菌和黄色镰刀菌产生[17]。呕吐毒素有着较稳定的物理性质与化学性质[18]，在加工、储存过程中不会被破坏，对畜牧业有很大影响[19-20]。在早期的研究中发现，当呕吐毒素在饲料中含量超过1 mg/kg时受试动物普遍产生厌食行为且生长受到影响[21]，降低动物机体的免疫力和消化吸收能力[18]。呕吐毒素乙酰化后的衍生物有3-乙酰基-脱氧雪腐镰刀菌烯醇（3-AC-DON）和15-乙酰基-脱氧雪腐镰刀菌烯醇（15-AC-DON），据Alizadeh 等[22]研究指出3-乙酰基-脱氧雪腐镰刀菌烯醇（3-AC-DON）、15-乙酰基-脱氧雪腐镰刀菌烯醇（15-AC-DON）对细胞的不利影响较呕吐毒素大。

昆虫作为全球种类最多的生物类群体，占据了地球一半以上的物种数目，是非常可观的可再生资源[23]。其体内富含必需氨基酸、单不饱和脂肪酸、多不饱和脂肪酸和一些的微量元素，有成为食物或蛋白源的潜力[24]。黑水虻（Black Solider Fly）其体内的粗蛋白质含量与蚕豆、葵花籽等植物性蛋白饲料相近[25]，有作为饲料粮的潜力。黑水虻的幼虫以动物粪便，腐烂的水果为食物，食量大，食性杂,目前被用在无害化处理粪便与餐厨垃圾的研究上[26]。经研究表明黑水虻幼虫对含有0.5 μg/mg黄曲霉毒素的饲料具有耐受性并且毒素不会积累在其体内[27]。利用黑水虻处理受霉菌毒素污染的谷物，再把黑水虻作为牲畜的饲料，既可以有效利用废弃谷物，又可以缓解未来蛋白质饲料紧缺的问题，一举两得。本文通过研究黑水虻对呕吐毒素的耐受性与积累量，以探究黑水虻在处理受污染饲料的应用价值和作为饲料的安全性。

1 材料与方法

1.1 材料

黑水虻（24 h 龄幼虫）由广州无两生物科技有限公司提供；脱氧雪腐镰刀菌烯醇（100.7 μg/ml）、3-乙酰基-脱氧雪腐镰刀菌烯醇（100.3 μg/ml)）、15-乙酰基-脱氧雪腐镰刀菌烯醇（100.12 μg/ml）均购自ROMER 国际贸易（北京）有限公司；HLB 固相萃取柱（60 mg，美国Waters 公司）；固相萃取装置（12 管，Su-pelco）；KL512型氮吹仪（金坛市盛蓝仪器制造有限公司）；乙腈、甲醇为色谱级（美国Ho-neywell 公司）；实验室用水均为Milli-Q 超纯水仪制备得到；Poroshell 120 EC-C18 色谱柱(4.6 mm×150 mm，2.7 μm，Agi-lent)；高效液相色谱-串联质谱仪（日本岛津公司）；4500 QTRAP串联质谱仪（AB SCIEX公司）。

1.2 方法

1.2.1 饲料准备

用一定量乙腈稀释100.7 μg/ml 的脱氧雪腐镰刀菌烯醇(DON)溶液，将上述溶液喷于饲料上，混匀，得到20 mg/kg 呕吐毒素的有毒饲料。将适量的有毒饲料和无毒饲料混合得到20、10、5、2.5、1、0.1 mg/kg的有毒饲料，每组三个平行。

1.2.2 黑水虻饲养

取各浓度饲料4 g 与4 ml 的水混合，置于带盖培养盒中，将100只黑水虻幼虫（24 h内破茧）置于培养盒中，用带孔的盖子盖住以便换气，将盒子置于培养箱中[（27±1）℃，（88±1）%相对湿度]培养15 d，期间改变盒子在培养箱中的位置，以消除位置的影响。15 d后，取出盒子称重，将虫子、残渣分开称重，将带有残渣的幼虫收集，用清水洗去残渣，用纸巾擦干幼虫，再称重。将黑水虻置于新的培养盒中，给予4 g 无毒饲料培养，2 d后按照上述的步骤收集并记录黑水虻、残渣的重量。

1.3 样品前处理、呕吐毒素及衍生物含量分析

称取1 g 样品于10 ml 离心管中，加2 ml 水和1 g氯化钠，涡旋均匀，静置5 min，加入乙腈3 ml，超声提取30 min，8 500 r/min离心5 min，取乙腈层于离心管中，加入乙腈饱和的正己烷混合液2 ml，涡旋混合，离心2 min，弃去正己烷层，再加入2 ml乙腈饱和的正己烷混合液2 ml 重复操作一次，将下层溶液于50 ℃氮吹至近干，加水溶解残渣，待净化。将HLB 固相萃取柱连接到固相萃取装置上，依次用3 ml甲醇和3 ml水活化，将待净化液上柱，用5 ml 水淋洗，减压抽干后，用5 ml甲醇进行洗脱，收集洗脱液，于50 ℃氮吹至近干，用30%乙腈水复溶，过膜，待上机。

1.4 色谱条件

色谱柱：Agilent Poroshell 120 EC-C18柱(4.6 mm×150 mm，2.7 μm)；柱温：40 ℃；进样量：10 μl；流动相A：0.01%氨水，流动相B：30%乙腈；梯度洗脱程序：0～5 min：30%～95% B；5～6 min：95% B；6～6.1 min：95% B～30% B；6.1～10 min：30% B；流速：0.5 ml/min。

1.5 质谱条件

离子源：电喷雾离子源（ESI）；扫描方式：负离子（ESI-）扫描；检测模式：多反应监测（MRM）；电喷雾电压：-4 500 V；离子源温度：550 ℃；气帘气、雾化气、辅助加热气、碰撞气等在使用前调节各流量使质谱灵敏度达到检测要求；去簇电压、碰撞电压应优化最优灵敏度。

1.6 数据处理

试验数据以3次重复的“平均值±标准误”表示，数据处理采用Graphpad Prism7.0软件进行，差异显著性分析和相关性分析采用SPSS24.0软件进行，显著水平设为0.05，以P＜0.05作为差异显著性判断标准。

2 结果

2.1 质谱行为

根据呕吐毒素及其衍生物的分子结构特征，选择ESI-电离模式。对质谱条件进行优化，确定3种毒素的母离子和子离子，以强度较大的子离子作为定量离子，强度稍小的子离子为定性离子，各化合物的定量离子及定性离子见表1。

表1 DON、3-AC-DON、15-AC-DON标准溶液的质谱参数

2.2 色谱行为

图1 DON、3-AC-DON、15-AC-DON混合标准溶液的MRM色谱图

如图1 所示，DON、15-AC-DON、3-AC-DON 的混合标准品的色谱图，色谱峰没有相连，相互影响小，分离效果佳，出峰时间分别为3.42、4.43、4.57 min。

2.3 饲料（加标后）毒素浓度（见表2）

表2 各组别饲料加标后DON的实际浓度

实测DON浓度的相对标准偏差在1.5%～5.2%,毒素混匀效果理想。在对照组中检测出了0.03～0.04 mg/kg的DON，说明饲料本身带有一定量的DON。

2.4 呕吐毒素对黑水虻生长性能的影响(见图2)

单因素方差分析结果表明：溶剂组与对照组无显著性差异（P＞0.05），说明乙腈对黑水虻幼虫的生长没有影响；试验组中黑水虻幼虫的存活率达80%以上，平均体重达60 mg/条，与对照组无显著性差异（P＞0.05）；因此DON 的浓度并不影响黑水虻幼虫的生长性能。

图2 不同浓度DON对黑水虻生长性能的影响

2.5 呕吐毒素在黑水虻虫体及代谢残渣中的累积（见图3）

空白对照组和溶剂对照组中检测到的DON浓度为30～40 μg/kg，饲料本身有一定量的呕吐毒素。黑水虻虫体内的DON 浓度为1～3 μg/kg，远低于饲料中的DON含量，饲养的饲料基本全被吃完，说明了DON不在虫子体内积累。随着呕吐毒素浓度的增高，残渣（加标）中DON 的浓度也随之增高，说明虫子会排出一定量的DON。2 d洁净饲料饲养后的残渣（含饲料）DON浓度与空白饲料浓度有显著差异（P＜0.05），推测高浓度时虫子排出较多毒素，毒素浓度被提高。残渣（加标）中DON浓度与饲料中的DON浓度有显著性差异（P＜0.05），残渣（不加标）中DON的含量与对照组有显著性差异（P＜0.05），推测黑水虻降解部分毒素。

2.6 呕吐毒素衍生物（见表3）

虫体、饲料（加标后）、残渣（加标）、残渣（不加标）中的3-AC-DON 和15-AC-DON 均低于检测限，DON没有被转化成毒性更强的衍生物。

2.7 物料平衡

图4体现了各试验组中虫体、代谢残渣中DON及其衍生物占加标饲料毒素量的比率。试验中DON的损失率随着DON浓度增大而升高，2.5、5、10、20 mg/kg试验组中DON 损失率达95%以上，说明虫体消化了DON 且高DON 浓度时消化效率更高。空白组、溶剂组和0.1 mg/kg 组，其虫体和残渣（加标）中的DON 占的比例较大为6.7%～13.8%。1、2.5、5、10、20 mg/kg试验组中，残渣（加标）的DON占比例为1.2%～3%，其他部分占比均不足1%。

图3 呕吐毒素在黑水虻虫体及残渣中的含量

表3 呕吐毒素衍生物的检测

图4 加标饲料的质量守恒

3 讨论

本研究评估了黑水虻对不同呕吐毒素浓度的耐受性及积累量，进一步探究黑水虻在处理受毒素污染的饲料上的应用价值及其作为饲料、食物用蛋白质源的安全性。呕吐毒素不影响黑水虻的生长性能（P＞0.05），呕吐毒素在昆虫体内的残留量低于国家限量标准，黑水虻表现出极强的呕吐毒素耐受性且可将其代谢分解排出体外。与动物源食品相比，昆虫类食品在保证必需微量营养素摄入的同时，具有显著的环境效益及安全性；与植物源食品相比，昆虫中必需营养素的丰富性使它们成为当前动物源食品的优质替代品。昆虫在未来食品中具有可持续发展及健康饮食上的潜力。黑水虻对混合毒素、其他单一毒素的耐受性及积累量、呕吐毒素在黑水虻体内的代谢途径有待进一步研究。

4 结论

本文探究了DON对黑水虻幼虫的生长影响以及在黑水虻幼虫中的积累。试验证明：DON不影响黑水虻幼虫的生长性能（P＞0.05），DON在黑水虻幼虫中的积累量在1～3 mg/kg的水平中，属于安全的水平，黑水虻幼虫可降解大部分的DON，DON 在黑水虻幼虫中不会转化为毒性更强的呕吐毒素衍生物3-AC-DON或15-AC-DON，黑水虻幼虫可代谢DON。