余 华， 叶健强， 严玉宝， 谢 晶， 胡 娟， 康润敏， 周岷江， 廖党金， 崔鹏博， 叶勇刚， 于吉锋， 肖 璐， 曹 冶， 魏 甬， 李兴玉， 林 毅， 潘 梦， 戴卓建

(1.四川出入境检验检疫局， 四川 成都 610041； 2.四川省畜牧科学研究院， 四川 成都 610066； 3.动物遗传育种四川省重点实验室， 四川 成都 610066)

恩拉霉素(Enramycin，Er)，又名安来霉素和持久霉素，由日本武田药品研究所于1966年发现，是放线菌(StreptomycesfungicidiousNO. B5477)发酵产生的一种由不饱和脂肪酸和十二种氨基酸结合成的多肽类(Polypepide)抗生素[1-2]，其主要成分是恩拉霉素A(C107H138C12N26O31R=CH3)和恩拉霉素B(C108H140C12N26O31R=C2H5OH)。该药具有很强的抗G+菌作用，用作饲料添加剂能促进畜禽生长和提高饲料效率，长期使用不易产生耐药性，与其他抗生素亦无交叉耐药；其化学性能稳定，无致突、致畸及致癌作用，残留极少，适口性好。现已成为当前最具发展前景的兽用抗生素添加剂。

免疫分析法较传统微生物检测法、理化检测法具有简洁、快速、廉价、特异性强和灵敏度高等优点，已被国内外广泛应用于兽药残留的检测，但至今国内外尚无有关恩拉霉素酶免疫检测技术的报道[3-5]，仅日本厚生省对该项残留物质有畜、水产性食品常规检测技术报道[6]。因此，开发我国自主产权的恩拉霉素残留检测方法对恩拉霉素酶免疫检测技术具有重要意义。建立相关免疫学分析方法，制备出特异性强且效价高的恩拉霉素抗体是关键，必须将其与蛋白质载体等大分子载体偶联形成人工合成的完全抗原进而制备相应抗体[7]，这也是建立免疫分析过程的前提和关键所在。鉴于此，在恩拉霉素人工抗原合成试验的基础上，采用正交试验对抗原合成条件和主要影响因素进行优化，以期为进一步制备抗Enramycin多克隆抗体、单克隆抗体及检测试剂盒奠定基础，并为恩拉霉素残留检测方法的建立提供参考。

1材料与方法

1.1供试材料

1.1.1试剂恩拉霉素，纯度≥98%，由项目组提纯；牛血清白蛋白(BSA)，相对分子质量67 kDa，上海博奥生物科技公司；卵清蛋白(OVA)，相对分子量45 kDa，上海基星生物科技公司；弗氏完全佐剂(FCA)和弗氏不完全佐剂(FICA)，Sigma公司；透析袋，截留分子量14 kDa，Sigma公司；戊二醛，成都金山化学试剂公司；1，4-二氧六环，成都科龙化工试剂厂；Na2HPO4·2H2O，天津博迪化工公司；NaH2PO4和Na2CO3，成都长聊化工试剂有限公司；乙二胺四乙酸二钠，天津华兴精细化工公司。以上试剂均为分析纯。

1.1.2仪器UV2501-PC型紫外扫描仪，日本岛津Shimadzu公司；BS124S型电子天平，北京赛多利斯仪器系统有限公司；BS 100S型分析天平，北京赛多利斯有限公司；ULT1386-3-V38型低温冰箱，美国REVCO公司；DCD-172K型常规冰箱，美国伊莱克斯公司；Freeze 6型冷冻干燥机，Labconco公司；DF-101S型智能集热式恒温加热磁力搅拌器，河南省予华仪器有限公司。

1.2试验方法

1.2.1试验设计在采用戊二醛法(glutaraldehyde)合成恩拉霉素人工免疫抗原(图1)的基础上，选取影响恩拉霉素人工抗原合成偶联率的反应物质量比例、反应溶剂比例、温度及pH等因素，采用L9(34)正交试验进行4因素3水平的试验因素与水平设计(表1和表2)，以确定恩拉霉素人工抗原合成的最佳方案。其中，溶剂的比例以PBS与1,4-二氧六环的体积比表示，相同反应温度的各处理在同一全温培养摇床中进行反应，pH通过缓冲液PBS调节及维持。

图1恩拉霉素人工免疫抗原合成路线

表1恩拉霉素人工免疫抗原合成的 L9 (34) 正交试验因素与水平

注：表中mBSA、mEr分别为牛血清蛋白(BSA)和恩拉霉素(Enramycin)的质量。

Note: mBSAand mErare BSA and Enramycin mass respectively.

表2恩拉霉素人工免疫抗原合成L9(34)正交试验方案

1.2.2恩拉霉素人工免疫抗原的制备过程取一定量的BSA于一试管中，然后根据表1中PBS与1,4-二氧六环的体积比加入相应体积的PBS溶液，等BSA完全溶解后即得试验用溶剂。根据表2各试验方案取相应量的恩拉霉素分别盛于锥形瓶中，将上述配制的溶剂分别加入其中后摇匀，待恩拉霉素基本溶解后，再向锥形瓶中加入相应量的1,4-二氧六环，混匀。将磁力搅拌子放入锥形瓶后将其放入一个盛有水的大烧杯中，于25℃下边搅拌边水浴，5 min后在保持搅拌状态下，向反应器内逐滴加入0.25%的戊二醛溶液数5 mL，之后仍保持搅拌状态反应4 h。经过透析，干燥后得目标物质。

1.2.3人工免疫抗原的鉴定及其偶联率采用UV2501-PC型紫外扫描仪对Er、BSA和制备的人工免疫抗原进行紫外全波段(波长200～400 nm)扫描。当Er与BSA偶联形成免疫抗原后，其紫外最大吸收波长偏移至Er和BSA特征峰之间，则表明偶联成功，得到免疫抗原。根据吸光度计算各处理恩拉霉素人工免疫抗原的偶联率。

1.2.4最佳方案的选择利用Excel 2016对正交试验所得数据进行极差分析，根据极差的大小确定各因素对反应的影响；Ki和ki分别为因素第i水平(i=1，2，3)所在处理考查指标的总偶联率和平均偶联率，对Ki和ki进行比较，最大即为最优，以此确定恩拉霉素人工抗原的最佳合成工艺。

2结果与讨论

2.1人工免疫抗原的紫外光谱鉴定

从图2可知，Er标准品紫外最大吸收波长为279 nm，BSA紫外最大吸收波长为278 nm，合成物的紫外最大吸收波长偏移至Er和BSA特征峰之间，表明，Er与BSA偶联成功，得到免疫抗原Er-BSA。

图2恩拉霉素人工免疫抗原与BSA、Er紫外全波段扫描

2.2正交试验

各处理恩拉霉素人工抗原合成的偶联率为17.96～26.04，其中，处理7的偶联率最高，为26.04，处理2其次，为25.70，处理8最低，仅17.96。从表3看出，A、B、C和D 4个因素不同水平的极差依次为0.41、0.79、5.90和2.36，表明，4个因素对偶联率的影响依次为C>D>B>A，主要影响因素为反应物质量比和温度，而pH和反应溶剂比例为次要影响因素。结合图4对k值(表3)进行比较得出，恩拉霉素人工抗原合成的最佳方案为A3B1C2D2，即pH 7.7，VPBS∶V二氧六环为1∶1，mBSA∶mEr为1∶1，反应温度为28℃。

注：表中Ki为因素A、B、C、D的第i(i=1，2，3)水平所在的试验考查指标偶联率之和。

Note:Kipresents the coupling rate sum ati=1, 2 and 3 level of A, B, C and D factors respectively.

图3 Er-BSA直观分析图

2.3最佳方案的确定

对比分析发现，该最佳方案A3B1C2D2不在试验设计方案中，但与其中处理7(A3B1C3D2)较接近，处理7仅有反应物质量比(C因素)未处于最好水平，但其偶联率最高。由于确定最佳优化方案时不仅要看试验结果，同时也要结合极差分析结果进行综合考虑，因此，基于对重要因素反应物质量比(C因素)和温度(D因素)首选最佳水平，对次要因素反应溶剂比例(B因素)和pH(A因素)应综合考虑的原则，确定处理2(A1B2C2D2)为最佳方案，其Er-BSA偶联率仅次于处理7，为25.70，居第2位，表明，筛选的最佳方案符合实际，并且节约反应物(纯化后的恩拉霉素)。

3结论与讨论

通过L9(34) 正交试验方法对一步法合成恩拉霉素人工免疫抗原的反应条件进行优化，确定反应物质量比和温度是该反应的主要影响因素，最佳反应条件为反应物质量比( mBSA∶mEr) 为1∶1，反应温度28℃，VPBS∶V二氧六环为2∶1，pH 6.7，在此条件下，Er-BSA偶联率为25.70。

偶联物的结合比是指偶联物中半抗原与载体蛋白的分子个数之比，试验优化方案中符合实际的最佳方案为反应物质量比( mBSA∶mEr) 为1∶1，反应温度28℃，VPBS∶V二氧六环为2∶1，pH 6.7，其Er-BSA偶联率为25.70，仅次于反应条件为反应物质量比( mBSA∶mEr) 为2∶1，反应温度28℃，VPBS∶V二氧六环为1∶1，pH 7.7的偶联率(26.04)，居第2位。不同研究最佳偶联比的结果存在差异，通常认为半抗原分子与载体蛋白的偶联比为(5～30)∶1最佳[11]。该研究以结合比适当的偶联物作为人工抗原，能够获得效价高、特异性强的以BSA为载体的偶联物。