曹 剑,张丽敏

(赤峰学院附属医院,内蒙古 赤峰024000)

本实验制作小鼠周围神经损伤模型，应用熊果酸(ursolic acid,UA)进行干预,观察神经损伤后PSD95蛋白表达的变化及髓鞘的形态学变化，分析二者的相关性，探讨神经损伤后熊果酸对损伤后修复与再生的作用。

1 材料与方法

1.1 实验分组

选用BALB/c鼠做动物模型，共320只 (成年健康雄性，20±2 g,赤峰学院基础医学院实验动物中心提供)，坐骨神经损伤模型制作后，随机进行分组，将实验动物模型分为4组，分别是，熊果酸高、中、低剂量干预组和空白对照组；每组再根据神经损伤后时间，随机分为8组，分别为：12小时，1天，3天，5天、1周、2周，4周，8周，每组随机分配10只。饲养条件：室温,普通饮食。

1.2 实验动物造模

神经损伤实验动物模型制作：实验动物 BALB/c鼠，应用硫喷妥钠(1%浓度，100 mg/kg)进行腹腔麻醉,麻醉成功后，将实验动物俯卧位固定于固定板上,双下肢及会阴部脱毛，碘伏消毒，取单侧下肢后方，坐骨神经走行部位纵切口约1.5 cm,切开皮肤，显露皮下梨状肌下，于梨状肌下显露坐骨神经,随后钝性分离坐骨神经主干,将神经主干在坐骨结节下约0.5 cm处离断,显微镜下吻合离断的坐骨神经,将切口逐层缝合。

1.3 药物干预

将神经损伤模型动物进行腹腔给药。给药剂量参照临床应用熊果酸原药剂量，进行等效换算[1]，换算后数值作为熊果酸干预的中等剂量，高剂量组与低剂量组以中等剂量组等比数列计算确定。通过换算得出各组给药量数值分别为：20 mg/kg/d，10 mg/kg/d，5 mg/kg/d。以生理盐水溶解后按照换算剂量腹腔注射给药。生理盐水对照组给予同等体积生理盐水腹腔注射。熊果酸连续干预1周。熊果酸纯度：>99.6%(T) 购于四川德思特生物有限公司，型号：DX0019。

1.4 实验动物标本取材及制备

将每组模型动物在设定时间点进行取材，取材步骤如下： 1%硫喷妥钠100 mg/kg腹腔麻醉后，在各时间点取各组模型动物5只，以原切口切开皮肤，显露坐骨神经，切取坐骨神经自吻合口向远近端延申约3 mm的神经干(全长约6 mm)，将神经标本标记后迅速浸置于液氮中备用。将每组剩余5只以上述方法切取坐骨神经干6 mm，以10%中性甲醛进行固定，72小时后将标本经酒精脱水后石蜡包埋备用。

1.5 标本检测方法

1.5.1神经标本PSD95的Real-time PCR检测 检测步骤如下：1)引物合成：设计PSD-95(Beacon designer 7软件)、以GAPDH为引物(表1)，结果经Blast检索验证引物的特异性。2)取坐骨神经损伤段组织标本，应用Trizol提取总RNA，并以提取的总RNA为模板进行逆转录制备cDNA库。随后以cDNA库为模板,进行PSD-95的PCR扩增，在各个反应体系中均加入GAPDH的一对引物作为PCR扩增的内参，反应条件为：95℃ 30 s-58℃ 60 s-72℃ 60 s 共进行40个循环。

表1 PSD-95、GAPDH引物设计

1.5.2LFB髓鞘染色 将甲醛固定72小时后的神经标本经酒精脱水，石蜡包埋后切片行HE染色。先进行初步筛选，观察髓鞘的结构及神经损伤处增生及恢复情况，通过初步筛选确定LFB染色对象。将初筛后的石蜡标本切片脱蜡后，置入60℃ LFB液中浸泡12小时；随后应用95%酒精浸泡5分钟；再加入0.05%碳酸锂溶液静置15 s；最后应用70%的酒精进行洗涤，再经蒸馏水洗涤后脱水透明封片。

2 结果

2.1 Real time-PCR结果

实时定量PCR结果显示：在正常BALB/c鼠神经组织中PSD-95 mRNA仅有少量表达,而在坐骨神经损伤模型中,神经损伤节段的组织中PSD-95 mRNA 的表达在神经损伤的初期呈上升趋势,并且由神经损伤后12 h-2 w周期中表现随时间递增的趋势,各模型组组间可见明显差异，熊果酸高剂量组和中剂量组在各时间点的增加量均低于熊果酸低剂量和生理盐水对照组。但是在2 w后PSD-95 mRNA的表达量在各剂量组中的表达量呈下降趋势(见图1)。

图1 神经损伤后PSD-95的mRNA表达

2.2 神经标本髓鞘LFB染色结果

神经标本经LFB快蓝染色后，神经髓鞘颜色表现为浅蓝色，而神经轴突透明无法着色，图片背景显示白色。造模后8周的筛选标本染色结果显示：熊果酸高剂量组(H组)和中剂量组(M组)的髓鞘形态呈规则排列，并且髓鞘厚度相对均匀；同时观察到髓鞘的轮廓清晰，局部组织轻度增生；而熊果酸低剂量组(L组)髓鞘形态不规则且薄厚不均，髓鞘的轮廓可辨别，神经束间结缔组织增生明显；生理盐水对照组(B组)髓鞘形态不规则，局部可见大量纤维结缔组织增生(见图2)。

a.高剂量组.b.中剂量组 c.低剂量组 d.对照组

2.3 实验动物模型标本有髓纤维平均直径和有髓纤维数目测定

将各组动物模型LFB染色标本镜下随机选取视野进行图像分析，计算有髓神经纤维的数目和平均直径，并对结果进行统计学分析。结果表明,有髓神经纤维的数量和直径在高、中剂量组显著高于低剂量组和模型组(P<0.05),表明高级神经再生高、中剂量组神经损伤后恢复情况优于低剂量组和模型组(表2)。

表2 造模8周后各组有髓神经纤维数目及其平均 直径变化

综上所述，坐骨神经损伤模型中PSD-95 mRNA的变化与神经髓鞘LFB染色的有髓神经纤维数目及其平均直径变化趋势呈反比。

3 讨论

熊果酸是三萜类化合物并以化合物的形式存在于许多天然植物中，有研究表明熊果酸具有抗炎、镇静以及降低血糖等功效；同时它还是一种抗氧化剂，在医药和化工领域有广泛的应用[2]。UA的作用机理是：可以迅速降低ALT、GPT具有降黄疽、增进食欲、缓解纤维化的作用，对肝功能的恢复具有调节作用。

当UA浓度(5-15 μmol/L)时对抗谷氨酸受体激动剂红藻氨酸诱导大鼠海马神经元自由 基形成、线粒体膜电位下降[3]。熊果酸作为一种强抗氧剂，通过调节体内氧化- 还原平衡，减少氧化应激造成的损伤，从而发挥其神经保护作用。但目前，关于其对周围神经损伤后的保护性作用未见报道[4-7]。PSD95(突触后密度蛋白，postsynaptic density protein 95)又称为神经骨架蛋白，可以反映突触的形态和密度。PSD95的结构由N 端3个重复的PDZ和SH3以及C 端的GK 结构域三部分组成。其中PDZ 结构域是其主要功能单元,能够关联和协调蛋白质间的功能域，使其特异地与离子通道和相关受体的靶点蛋白的C 端紧密结合。PSD-95 的第2 个PDZ 结构域可以同时结合NMDA 受体中NR2B亚基C 端第7个氨基酸和一氧化氮合酶nNOS构成NMDAR/PSD-95/nNOS三二聚体[8]。中间结构域SH3则可以结合Ras 相关效应器蛋白和肌动，具有介导模体的作用。另一个GK 结构域和酵母的胍氨酸激酶具有同源性[9]。有研究表明PSD-95可以关联突触后神经元黏附分子neuroligins 和突触前膜外伸蛋白neurexins，对突触结构连接和功能的表达具有正向调节作用。位于第二和第三个PDZ之间存在的残基丝氨酸-295 对神经元的突触可塑性具有调控作用：丝氨酸-295 的磷酸化可以促进PSD-95 的聚集并促进突触的长时程，相反丝氨酸-295的去磷酸化则抑制突触的长时程[10]。有研究证实：PSD-95可以将膜蛋白稳定在突触水平，同时还可以调控膜蛋白的功能，NMDA 受体的门控通道具有PSD-95 剂量依赖性，与此同时PSD-95对钾通道具有内向聚集功效[11-14]。通过本实验研究发现： Real-time PCR的检验结果表明在BALB/c鼠坐骨神经损伤后，神经损伤段的PSD-95被激活并大量表达，增加了局部的炎性反应和瘢痕增生，抑制了神经髓鞘的再生，应用熊果酸后高中剂量组的PSD-95表达明显低于于低剂量组及对照组。坐骨神经损伤后应用熊果酸可以对PSD-95的活化起到持续抑制作用,达到神经损伤后的保护作用，为神经的再生创造条件。

通讯作者简介：张丽敏，女，55岁，医学硕士，法学硕士，教授，主任医师，赤峰学院附属医院院长，赤峰学院医学院院长，邮箱：zlm0476@163.com。