叶玉兰，刘单，邓述恺

（西南医科大学附属医院 呼吸与危重症医学一科，四川 泸州 646000）

选择环氧合酶-2（Cyclooxygenase-2,COX-2）抑制剂塞来昔布（Celecoxib,Cele）具有抗炎、解热、镇痛作用。近年来大量研究发现，Cele 对包括肺癌[1]在内的多种恶性肿瘤均表现出抗癌活性[2-3]，但具体机制尚未完全明确。培美曲塞（Pemetrexed,Pem）是一种多靶点的抗叶酸化疗药物，被推荐用于非鳞非小细胞肺癌的一线治疗[4]。磷脂酰肌醇-3-激酶（phosphatidylinositol -3-kinase,PI3K）家族是一类重要激酶，而蛋白激酶B（protein kinase,B）是PI3K 信号通路的核心靶点。 PI3K/AKT 通路广泛存在真核细胞中，与细胞生长、增殖、分化调节密切相关[5]。本实验拟通过Cele、Pem单药和联合用药与人肺腺癌A549 细胞共培养，研究Cele 与Pem 联合对肺癌细胞的增殖、凋亡的影响，并初步探讨其可能的作用机制，以期为临床肺癌化疗提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 主要试剂及材料

A549 细胞株（西南医科大学中心实验室），Cele（上海阿拉丁生化科技股份有限公司），Pem（美国Selleck 生物科技有限公司），CCK-8 检测试剂盒、细胞凋亡及周期检测试剂盒（上海碧云天生物技术有限公司），HyClone 改良型RPMI 1640 培养基（北京赛默飞世尔生物化学制品有限公司），BCA 蛋白质浓度测定试剂盒（武汉阿斯本生物技术有限公司），兔抗人AKT 一抗及p-AKT 一抗（美国CST 公司），内参GAPDH 抗体（英国Abcam 公司），山羊抗兔二抗（南非Aspen 公司），流式细胞仪（美国BD 公司）。

1.2 研究方法

1.2.1 细胞复苏、培养及传代 将A549 细胞株培养于RPMI 1640 培养基（含10%胎牛血清）中，置于5%二氧化碳CO2、37℃、恒温培养箱内，贴壁生长至85%时用0.25%胰酶消化传代。

1.2.2 CCK-8 法检测不同浓度下细胞组增殖抑制率和光密度（OD）值 将A549 细胞接种于96 孔板，温育24 h，加入Cele（0、5、10、20、40 及80 μmol/L）、Pem（0.0、0.5、1.0、2.0、4.0 及8.0 μmol/L）后继续培养48 h，CCK-8 法检测OD 值，并计算半抑制浓度（IC50）用于后续实验的药物浓度。

1.2.3 CCK-8 法检测各实验组细胞增殖抑制率 将A549 细胞接种于96 孔板，分为对照组（加入培养液）和实验组，实验组又分为Cele 组（加入IC50浓度的Cele）、Pem 组（加入IC50浓度的Pem）、Cele+Pem组（加入IC50浓度的Cele 和Pem），每组设5 个复孔。37℃5% CO2培养箱中分别培养24、36 和48 h 取出，加入CCK-8 试剂，孵育4 h。酶标仪测量450 nm 波长处的OD 值，计算增殖抑制率。结合前期预实验，48 h增殖抑制效果最佳，择其作为后续药物实验干预时间。

1.2.4 流式细胞仪检测细胞凋亡 将A549 细胞接种于6 孔板，分组同1.2.3 部分，室温孵育48 h，收集细胞；加入300 μl Binding Buffer 悬浮细胞；加入5 μl Annexin V-FITC，混匀，避光孵育10 min，再加入5 μl PI，混匀，避光孵育5 min，上机检测。

1.2.5 流式细胞仪检测细胞周期分布 将A549 细胞接种于6 孔板，分组同1.2.3，室温孵育48 h，收集细胞，PBS 洗3 次，加入预冷的70%乙醇，4℃固定过夜。收集细胞，PBS 洗涤3 次，加入500 μl RNase/PI 重悬细胞，避光染色20 min，上机检测。

1.2.6 Western blotting 检测AKT、p-AKT 蛋白水平 将A549 细胞接种于96 孔培养板，分组同1.2.3，室温孵育48 h，裂解液裂解细胞后提取总蛋白。BCA 法检测蛋白浓度，制定标准曲线，计算各组蛋白浓度。凝胶电泳，转膜，5%脱脂牛奶封闭，AKT 及p-AKT 一抗4℃过夜，TBST 洗膜，加二抗，洗膜，ECL 发光剂显影，拍照。

1.3 统计学方法

数据分析采用SPSS 17.0 统计软件。计量资料以均数±标准差（±s）表示，多组间比较采用重复测量设计的方差分析，两组比较采用LSD-t检验，方差齐性检测采用Levene 法，P＜0.05 为差异有统计学意义。金氏法评价两药联合的相互关系，计算公式：Q 值= EA+B/（EA+EB-EA×EB）。结果判读：若Q 值＜1，两药之间相互拮抗；Q 值=1，两药之间作用相加；Q值＞1，两药之间相互协同。所有实验过程均重复3 次。

2 结果

2.1 不同浓度Cele 和Pem 单药对A549 细胞增殖的抑制作用及IC50

浓度为5、10、20、40 及80 μmol/L Cele 干预组细胞增殖抑制率分别为（17.300±3.988）%、（39.504± 1.656）%、（47.236±1.895）%、（51.662±5.387）% 和（63.379±1.986）%，差异有统计学意义（F=133.341，P=0.000），随着药物浓度增加，各组细胞增殖抑制率逐渐上升，但低浓度Cele（5 μmol/L）抑制作用与对照组差异无统计学意义（P＞0.05）；浓度为0.5、1.0、2.0、4.0 及8.0 μmol/L Pem 干预组细胞生长抑制率分别为（28.976±3.483）%、（46.072±1.249）%、（60.735± 2.892）%、（70.359±3.886）%和（79.545±2.531）%，差异有统计学意义（F=230.315，P=0.000），随着药物浓度增加，各组细胞增殖抑制率逐渐上升。实验得知Cele IC50值为30.51 μmol/L，Pem IC50值为1.33 μmol/L。 见图1。

2.2 Cele 联合Pem 对A549 细胞增殖的抑制作用

IC50浓度条件下，各实验组与对照组作用于A549细 胞24、36 和48 h 对A549 细 胞增殖 抑 制 作用比较，采用重复测量设计的方差分析，结果：①不同时间点的细胞增殖抑制率有差异（F=1107.544，P= 0.000）；②两组细胞的增殖抑制率有差异（F=149.865，P=0.000）；③两组的增殖抑制变化趋势有差异（F= 2291.635，P=0.000）。见表1。

2.3 金氏法评价Cele 联合Pem 对A549 细胞增殖抑制作用

Cele 联合Pem 与A549 共培养48h，Q 值为1.001，约等于1，说明Cele 与Pem 联合干预体外培养的A549细胞增殖。

图1 不同浓度Cele 和Pem 作用于A549 细胞 48 h 的增殖抑制率比较 （±s）

2.4 Cele 联合Pem 对A549 细胞凋亡的影响

作用于A549 细胞48 h 条件下，对照组、Cele 组、Pem 组及Cele+Pem 组细胞凋亡率分别为（2.900± 0.900）%、（10.190±1.778）%、（11.813±0.846）%和 （24.630±0.252）%，差异有统计学意义（F=208.388，P=0.000）；各实验组细胞凋亡率与对照组比较，差异有统计学意义（P＜0.05），均有所上升；Cele+Pem 组细胞凋亡率与Cele 组、Pem 组比较，差异有统计学意义（P＜0.05），Cele+Pem 组细胞凋亡率增加；而Cele组细胞凋亡率与Pem 组比较，差异无统计学意义（P＞ 0.05）。

2.5 各组A549 细胞周期分布情况

作用于A549 细胞48 h 条件下，对照组、Cele组、Pem 组及Cele+Pem 组G0/G1 分别为（52.487± 0.267）%、（65.393±0.368）%、（65.577±0.064）% 和（75.143±0.778）%，差异有统计学意义（F=1270.915，P=0.000）；与对照组比较，各实验组G0/G1 细胞比例均增加，差异有统计学意义（P＜0.05）；Cele+Pem 组细胞G0/G1 细胞比例与Cele 组、Pem 组比较，差异有统计学意义（P＜0.05），Cele+Pem 组增加；而Cele 组G0/G1细胞比例与Pem组比较，差异无统计学意义（P＞ 0.05）。见图2。

2.6 Cele+Pem 对A549 细胞AKT、p-AKT 蛋白表达的影响

作用于A549 细胞48 h 条件下，对照组、Cele组、Pem 组及Cele+Pem 组p-AKT/GAPDH 值分别为（0.544±0.033）、（0.267±0.042）、（0.157±0.014）和（0.063±0.021），4 组比较，差异有统计学意义（F= 148.409，P=0.000）；对照组、Cele 组、Pem 组 及Cele+Pem 组AKT/GAPDH 值分别为（0.684±0.054）、（0.656±0.025）、（0.673±0.021）和（0.648±0.011），4 组比较，差异无统计学意义（F=0.748，P=0.553）；与对照组比较，p-AKT/GAPDH 值在Cele 组、Pem 组及Cele+Pem 组均下调（P＜0.05），且Pem 组p-AKT/GAPDH 值低于Cele 组（P＜0.05），Cele+Pem 组p-AKT/GAPDH 值与Cele 组和Pem 组比较，差异均有统计学意义（P＜0.05）。见图3～5。

表1 Cele、Pem 单药和联合用药不同时间条件下对A549 细胞增殖的影响 （±s）

表1 Cele、Pem 单药和联合用药不同时间条件下对A549 细胞增殖的影响 （±s）

注：1）与对照组比较，P ＜0.05；2）与Pem 组比较，P ＜0.05；3）与Pem 组比较，P ＜0.05；4）与Cele 组比较，P ＜0.05；5）与24 h 比较，P ＜0.05

组别24 h 36 h 48 h OD 值 抑制率/% OD 值 抑制率/% OD 值 抑制率/%对照组 0.994±0.013 - 1.038±0.039 - 1.158±0.047 -Cele 组 0.816±0.004 18.311±0.4311）2） 0.701±0.010 32.314±1.0111）2）5） 0.581±0.048 49.743±4.1861）5）Pem 组 0.805±0.007 19.510±0.6781） 0.665±0.015 35.513±1.4741）5） 0.588±0.023 49.192±1.7781）5）Cele+Pem 组 0.724±0.005 26.755±0.5541）3）4） 0.443±0.018 57.098±1.7851）3）4）5） 0.320±0.037 72.370±3.2321）3）4）5）

图2 各组A549 细胞周期分布情况

图3 A549 细胞中p-AKT 及AKT 蛋白的表达

图4 A549 细胞中p-AKT 蛋白的表达 （±s）

图5 A549 细胞中AKT 蛋白的表达 （±s）

3 讨论

选择COX-2 抑制剂Cele，具有抗炎、解热、镇痛作用，近年来大量研究发现，Cele 对包括肺癌在内的多种恶性肿瘤均表现出抗癌活性[1-3]，其可能的机制为：阻断细胞周期进展，抑制细胞增殖及血管生成，诱导细胞凋亡[6-7]；抑制癌细胞浸润及转移[8-9]相关。KIM 等[10]研究发现，Cele 能够触发内质网应激，诱导人非小细胞肺癌细胞系A549 和H460 细胞凋亡。ZHANG 等[11]分别用Cele 和XIAP-shRNA 单独或联合作用于A549 细胞，发现各实验组增殖率均表现出下降，细胞凋亡上升。CAI 等[12]报道，当Cele 作用于体外孵育的A549，G0/G1 期细胞群由41.2%增至60.5%，从而认为Cele 能够诱导G0/G1 期停滞，影响细胞周期进展，在H1299 细胞株中也得到相似结果。与该结果类似，本实验结果表明，较高浓度Cele（10、20、40 及80 μmol/L）可抑制A549 细胞的增殖和活力，但低浓度Cele（5 μmol/L）抑制作用与对照组比较，差异无统计学意义。另外与对照组比较，Cele 能够增加A549 细胞G0/G1 期比例。

某项荟萃分析报道[13]，Cele 联合化疗可以显著改善晚期NSCLC 治疗的总体有效率。本实验通过使用Cele、Pem 单药和联合作用于体外培养的A549细胞，结果显示，与对照组比较，Cele、Pem 均呈浓度依赖性抑制A549 细胞增殖，且在IC50浓度条件下，Cele、Pem 呈一定时间依赖性抑制A549 细胞增殖，Cele+Pem 组抑制作用最强；各实验组A549细胞凋亡率及G0/G1 期细胞比例均有不同程度升高。WU 等[14]分析Pem 与作用于A549 细胞24 及48 h 后细胞周期分布情况，发现其呈剂量及时间依赖性诱导G1 期阻滞，另有学者报道[15]，将PC9 细胞同时暴露于Pem 和吉非替尼将导致明显G1 阻滞，本实验结果与之类似。金氏法显示Cele 联合Pem 作用于A549 48 h，Q 值为1.001，说明两者联合对A549 细胞增殖抑制起到相加作用，Cele 能增强Pem 抗肿瘤效应。

真核细胞中广泛存在PI3K/AKT 信号通路，原癌蛋白AKT 被认为是PI3K 下游中心效应分子，参与细胞生长、增殖、分化的调节。PI3K 能够通过AKT 将细胞分裂信号向下游传递，调控细胞周期蛋白D 表达，通过周期蛋白D1-CDK4-Rb 调控细胞周期，从而影响细胞增殖[16-18]。此外，p-AKT 能使Bcl-2（抗凋亡蛋白）从聚合体中释放出来，从而发挥抗凋亡作用。据报道，Cele 可抑制前列腺癌PC-3 细胞株中p-AKT 的表达，从而诱导细胞凋亡[19]；在非小细胞肺癌中，研究者发现放疗可以促进A549 细胞中p-AKT 的表达，而与各对照组相比，厄洛替尼+Cele 联合放疗组p-AKT 表达水平最低，从而认为厄洛替尼联合Cele 可能通过抑制PI3K/AKT 信号通路增强放疗的抗肿瘤效果[20]。以上研究提示AKT 可能是Cele 的作用靶点之一。本实验结果还发现，与对照组比较，Cele+Pem 组p-AKT 蛋白表达下降，而AKT 蛋白表达水平组间差异无统计学意义。表明AKT/p-AKT 至少部分参与了Cele 与Pem联合抗肿瘤的过程。

本研究表明，Cele 可增强Pem 抑制人肺腺癌A549细胞增殖、诱导细胞凋亡作用，其机制可能与诱导细胞周期G0/G1 期阻滞，抑制PI3K/AKT 通路相关蛋白AKT活性相关。其联合应用有望成为治疗NSCLC 的有效策略，但尚需进一步体内实验及相关临床试验进行验证。