王建萍，李公存，沙玉芬，顾亮，刘笑宏，苏佳明

(烟台市农业科学研究院，山东 烟台 265500)

蓝莓属杜鹃花科越橘属植物，原产于北美和东亚，是世界上少见的真正蓝色浆果[1]。蓝莓果实中含有较多的花色素苷、黄酮等生理活性成分，具有防止脑神经衰老、增强心脏功能、明目及抗癌等独特功效[2]，是近年许多国家发展十分迅速的优良果树之一，尤其是欧美国家[3-4]。我国对蓝莓的应用可追溯到20世纪50年代，东北地区的笃斯蓝莓被用来酿酒[5]。20世纪80年代，吉林农业大学郝瑞教授最先率队对长白山地区的野生笃斯蓝莓资源进行全面系统的调查研究，并开始野生蓝莓的驯化栽培工作[6]。到2017年我国蓝莓栽培面积达到5.59万hm2，总产量15.43万t[7]，目前我国蓝莓栽培面积和产量列居全球第四位[8]。当前制约蓝莓产业发展的一个重要原因是育种周期长的问题，常规的育苗方法不能满足发展需求，而通过组织培养和脱毒技术可以获得比常规育苗更大量、更优质的种苗，满足市场上对蓝莓种苗的需求。本研究以蓝莓品种杜克和布里吉塔叶片为外植体，研究蓝莓叶片离体再生技术，旨在探讨蓝莓工厂化育苗技术体系。

1 材料与方法

1.1 材料

Cao等[9]研究发现，不同蓝莓品种叶片再生频率不同。本试验以继代培养的杜克和布里吉塔2个蓝莓品种试管苗为试验材料，由烟台农科院实验室保存。

1.2 方法

1.2.1 无菌苗的获得

4月取当年生无病虫害生长健壮的枝条，摘除叶片后放入加水的容器中，于0～4 ℃条件下冷藏2～3 d，接种前，用洗洁精将枝条洗刷干净，剪成3～4 cm的茎段，流水冲洗30 min，然后在超净工作台上将剪好的茎段用乙醇浸泡30 s，无菌水冲洗1次，然后用0.1%的升汞溶液浸泡8～12 min(根据枝条老嫩程度)，再用无菌水冲洗4～6次，剪去两端，接种于诱导培养基上进行培养。生长30 d后转移到改良WPM+ZT 0.5 mg·L-1培养基上继代培养。

1.2.2 叶片不定芽再生

采取继代培养30～35 d的试管苗中上部大小一致的幼嫩叶片，剪成0.3 cm见方，近轴面向下接种到预先配置好的培养基上，每个配方培养基上接种120片。以TDZ(一种新型植物生长调节剂，具有很强的细胞分裂素活性，可以促进植物芽的再生和繁殖)和ZT(一种细胞分裂素，具有促进细胞分裂、诱导芽的分化等作用)为激素，基本培养基为改良WPM培养基，蔗糖30 g·L-1，琼脂3.5 g·L-1，pH值为5.0～5.2。进行不同时间的暗培养，后转为光照培养。光照强度1 500～2 000 lx，光照时间14 h·d-1，培养温度(25±1)℃，空气相对湿度40%～70%。

1.2.3 暗培养

将叶片接种在培养基上，每个配方分成5份，分别置黑暗中培养0、5、10、15、20 d，后转为光照培养。

1.2.4 生根培养

外植体在增殖培养基上生长30 d左右，剪取高2 cm以上的植株接种到不同配方的生根培养基中，基本培养基为1/2改良WPM。

2 结果与分析

2.1 不同TDZ浓度对两个品种蓝莓叶片再生的影响

由表1可以看出，TDZ浓度越低，2个蓝莓品种叶片再生效果均越差。当浓度为0.5 mg·L-1时，杜克和布里吉塔再生频率分别仅有14.2%和10.0%；当TDZ浓度为2.5 mg·L-1时，杜克和布里吉塔再生芽叶片数均达到最高，再生频率分别为65.0%和58.3%。

2.2 不同ZT浓度对两个品种蓝莓叶片再生的影响

由表2可以看出，ZT浓度较低时，2个蓝莓品种叶片再生效果较差。当ZT浓度为0.5 mg·L-1时，杜克和布里吉塔再生频率分别仅为20.0%和15.0%；当ZT浓度为2.0 mg·L-1时，杜克叶片再生效果最好，再生频率达82.0%，布里吉塔叶片再生效果也较好；当ZT浓度为2.5 mg·L-1时，布里吉塔叶片再生效果最好，再生频率为65.8%，杜克叶片再生效果也较好，2个品种间差异不大。

2.3 TDZ和ZT搭配使用对蓝莓叶片再生的影响

由表3可知，不同配方培养基对杜克蓝莓叶片再生效果不同，在5号培养基上叶片再生效果最好，再生频率达90%；在6号培养基上再生效果较好，再生频率为66.7%；在2、3、4号培养基上叶片再生效果较差；在1号培养基上再生效果最差，再生频率仅为16.7%。

表2 不同ZT浓度对两个蓝莓品种叶片再生的影响

布里吉塔在6号培养基上叶片再生效果最好，再生频率为80%；在5号培养基上再生效果较好，再生频率为73.3%；在2、3和4号培养基上再生效果较差，在1号培养基上再生效果最差，再生频率仅为11.7%。

表3 不同培养基配方对蓝莓品种叶片再生的影响

2.4 暗培养时间对蓝莓品种叶片再生的影响

由表4可知，暗培养20 d，杜克再生芽数最多，再生频率为76.7%；暗培养15和10 d，再生芽数较高，再生频率分别为74.2%和62.5%；未经暗培养处理时，再生芽数最低，再生频率仅为33.3%。

表4 暗培养时间对蓝莓品种叶片再生的影响

暗培养15 d，布里吉塔再生芽数最多，再生频率达83.3%；暗培养20 d，再生芽数也较多，再生频率为73.3%；未经暗培养处理时，再生芽数最少，再生频率仅为31.7%。

由此可知，在对杜克和布里吉塔进行叶片培养时，经过一定时间的暗培养可显著提高叶片的再生频率和再生芽数。不经过暗培养，叶片虽有再生能力，但再生力较差。

2.5 生根培养

由表5可以看出，杜克在3号培养基上生根率最高，达100%，平均根长最长，为2.3 cm；2号培养基的生根率较高，为91%，平均根长2.1 cm；在1号和5号培养基上生根率较低，分别为37%和53%；在6号培养基上生根率最低，仅有21%，平均根长最短，仅为0.8 cm。

表5 不同培养基两个蓝莓品种不定梢生根情况

布里吉塔在3号培养基上生根率最高，也达到100%，平均根长为2.5 cm；在2号和4号培养基上生根率较高，分别为85%和87%，平均根长分别为2.0和2.1 cm；在1号和6号培养基上生根率均较低，分别仅有21%和17%。

3 小结与讨论

本研究表明，TDZ和ZT能较好地诱导杜克和布里吉塔叶片分化。TDZ浓度较低时，2个蓝莓品种叶片培养效果较差；随着浓度的升高，再生芽叶片数及再生频率明显升高，表明较高浓度的TDZ有利于蓝莓叶片再生；ZT浓度较低时，2个蓝莓品种叶片培养效果较差，随着浓度的升高，再生效果明显变好，但当浓度达到3.0 mg·L-1时，再生效果变差，说明低浓度和高浓度的ZT均不利于蓝莓叶片再生。TDZ和ZT搭配使用明显好于单独使用的效果，说明两者搭配使用有利于蓝莓叶片再生。

本研究发现，杜克和布里吉塔叶片再生效果差异不大，这可能与2个品种同属于北高丛蓝莓有关；试验结果表明，暗培养可明显提高蓝莓叶片不定芽再生能力，暗培养15 d时布里吉塔叶片再生能力最强，暗培养20 d时杜克叶片再生能力最强；结果表明，低浓度和高浓度的IBA均不利于蓝莓生根，浓度为1.5 mg·L-1时效果最好，生根率达100%。