何万领， 李晓丽， 杨龙帮， 李 冬

(河南科技大学动物科技学院， 河南 洛阳 471023)

砷(Arsenic,As)是广泛存在于自然界的一种金属元素，其毒性及其在环境中的行为与重金属相似，进入环境的砷具有难降解、形态多变和迁移特性[1]。环境中的砷主要有两个来源：一方面是自然因素，主要由成土母质分解而来，不同成土母质导致的土壤砷含量不尽相同[2]，我国土壤砷背景值为11.2 mg·kg-1[3]；另一方面是人为因素，其中采矿、冶炼、化工、化肥应用等是主要来源[4-5]，但自上世纪90年代至今，有机砷制剂在畜牧业中的广泛应用成为新的砷污染源[6]。研究证实，有机砷制剂主要在动物肠道内发挥作用，随后绝大部分以有机砷原形排出体外[7]。与工矿业污染不同，畜禽粪肥返田的传统利用方式使得养殖排泄砷可直接进入农田土壤，污染范围更广，与人类生活更为密切。王付民等[8]对15个猪场周围长期施用含砷猪粪的土壤及其作物砷污染研究表明，施用猪粪的土壤中砷含量均不同程度超过我国自然界最高砷背景值(15 mg·kg-1)，并使农作物中砷含量超过国家标准的10～40倍。

紫花苜蓿(Medicagosativa)是反刍动物优质的蛋白质饲料资源，也是非反刍动物优质的青绿饲料和蛋白质补充饲料[9]，再加上紫花苜蓿适应性强、产量高，一直以来在我国有较大面积的种植。尤其是近些年，随着国家粮改饲种植模式的推广，紫花苜蓿种植面积陡增，采用动物粪肥作为有机肥较为普遍，受砷、铜等重金属污染的可能性较大[10]。尽管有研究报道，紫花苜蓿对某些重金属具有较强的耐受性，并可能用作重金属污染修复的材料[11]。但从少量关于砷毒性的研究报道来看，砷对紫花苜蓿生长发育及生物量生产均是不利的[12-13]。

膨润土是以蒙脱石为主要成分的层状铝硅酸盐矿物，具有储量丰富、价格低廉、对环境无污染等优点。研究表明，膨润土比表面大(通常为30～100 m2·g-1)，因而具有较高的表面能、较大的吸附能力[14-15]。此外，膨润土还具有良好的吸收膨胀性和较大的阳离子交换容量(Cation exchange capacity,CEC，一般为0.8～1.2 mol·kg-1)，被认为是理想的重金属污染修复材料[16]。目前，膨润土在水体、底泥和土壤中镉、铅、锌、铜、铬等重金属污染修复方面已展现出较大潜力[17-19]。但膨润土在土壤砷污染修复方面的研究尚未见报道。

因此，本试验通过模拟典型有机砷阿散酸暴露试验，研究其对紫花苜蓿种子萌发和砷积累的影响，并通过添加钠基和钙基膨润土，研究其对典型有机砷污染的修复作用，为土壤砷污染修复治理及牧草安全生产提供试验参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

紫花苜蓿(劲能5010，加拿大碧青公司)种子由华丰草业提供。

钠基膨润土(蒙脱石含量≥80%、密度2～3 g·cm-3、表观粘度30～75 mPa.s)和钙基膨润土(蒙脱石含量≥60%、密度1.1～1.2 g·cm-3、表观粘度≥30 mPa.s)均由山东圣源冶铸材料有限公司提供。

阿散酸为饲料级，纯度为35%，购自河南省郑州桑园兽医市场。

供试土样采自河南科技大学试验牧场(34°6′30′′ N，120°0′10″ E)表层土，土壤类型为褐土，具体理化性质为pH7.52、有机质(Organic matter,OM)21.58 g·kg-1,CEC 16.73 cmol·kg-1,N 1.09 g·kg-1,P 1.35 g·kg-1,K 24.35 g·kg-1。

1.2 试验方法

1.2.1污染土壤制备 土样经剔除石子、树叶、草根、虫卵等杂质后，用木槌将土块敲碎，自然晾干，过2 mm筛。准确称取一定量阿散酸，用55～60℃溶解，并均匀喷洒于土样中，制成阿散酸含量分别为75 mg·kg-1和150 mg·kg-1的试验土样。以不加阿散酸的土样为对照土样。

1.2.2膨润土的钝化处理 将试验用膨润土置于65℃恒温干燥箱内烘至恒重，冷却后，按照重量比0.5%，1.0%，3.0%的比例，分别称取钠基膨润土或钙基膨润土与上述土样均匀混合。按照每个培养皿60 g，准确称取土样，并平铺于培养皿中，静置钝化3 d，从而制成种子发芽床。具体试验设计见表1。

1.2.3发芽试验 挑选颗粒饱满、均匀的苜蓿种子置于质量分数4%的KMnO4内消毒10 min，用自来水流水清洗，再用去离子水冲洗3次后，用滤纸吸干种子表面水分。每个培养皿中均匀放入30粒处理后的种子，每个处理3个重复，每日按照称量法加去离子水至恒重。种子培养于室温环境中。

表1 试验处理Table 1 Test treatments

注：砷水平为实测值

Note:The arsenic contents were experimentally measured

1.3 种子发芽指标测定

发芽试验期间，每隔24 h记录种子的发芽数，第15 d统计发芽率，并计算发芽指数，发芽结束后，每皿取10株，测量根长和芽长。

发芽率(%)=发芽种子数/试验种子粒数× 100%；

发芽指数(Germination index,GI)=∑(Gt/Dt) (Gt为t时间的发芽数，Dt为相应的发芽天数)；

活力指数(Vigor index,VI)=GI×S(GI为发芽指数，S为一定时期内的幼苗长度)。

1.4 砷含量测定

分别准确称取土样、根样各0.1000 g，地上部植株样品0.2000 g于三角瓶中，加入20 mL浓硝酸、2.5 mL浓硫酸和1.25 mL高氯酸，加盖放置过夜。次日置电热板上160～170℃消解，至冒白烟时取出冷却，再加入5 mL去离子水蒸发至冒白烟，将余酸赶尽即可，冷却。用去离子水将消化液洗入50 mL容量瓶中，加10 mL 5%(W/V)硫脲+抗坏血酸混合液，以5%(V/V)HCl定容。用双道原子荧光光度计(AFS-9130，北京吉天仪器有限公司，中国北京)测定消煮液中As含量。

1.5 统计分析

采用Excel2007整理数据，用SPSS13.0中的ONE-WAYANOVA模块进行统计分析，均值多重比较采用Duncans方法进行，以P<0.05作为差异显著性判断标准，结果以“平均值±标准差”表示。

2 结果与分析

2.1 膨润土对有机砷暴露下紫花苜蓿种子萌发的影响

由表2可知，有机砷污染降低了紫花苜蓿种子发芽率、发芽指数和活力指数。与空白组相比，75 mg·kg-1有机砷组紫花苜蓿种子发芽指数和活力指数显著降低(P<0.05)，150 mg·kg-1有机砷组发芽率显著低于对照组(P<0.05)，且随着有机砷污染水平增加，紫花苜蓿种子发芽指数和活力指数均显著降低(P<0.05)。在有机砷暴露的土壤中加入钠基膨润土能够降低砷毒性，与75 mg·kg-1和150 mg·kg-1有机砷暴露组相比，添加0.5%，1.0%，3.0%的钠基膨润土组紫花苜蓿种子发芽率分别提高了11.8%，15.42%，13.71%和39.23%，45.33%，48.33%(P<0.05)；与75 mg·kg-1有机砷组相比，添加1.0%和3.0%钠基膨润土组发芽指数显著升高(P<0.05)，与150 mg·kg-1有机砷组相比，添加0.5%，1.0%和3.0%钠基膨润土显著升高紫花苜蓿种子发芽指数(P<0.05)，1.0%和3.0%钠基膨润土显著增加种子活力指数(P<0.05)。

表2 典型有机砷暴露下钠基膨润土对紫花苜蓿种子发芽率、发芽指数和活力指数的影响Table 2 Effects of Na-bentonite on seed germination percentage,germination index and vigor index of Alfalfa exposed to typical organic arsenic

注：同列数据肩标字母不同者，表示差异显著(P<0.05)，下表同

Note:Different letters within the same column indicate significant difference at the 0.05 level,the same as below

表3为典型有机砷暴露下钠基膨润土对紫花苜蓿根长和芽长的影响，结果可知，与对照组相比，有机砷暴露显著降低紫花苜蓿根长和芽长(P<0.05)，且随着有机砷暴露水平增加，呈显著降低趋势(P<0.05)。与有机砷暴露组相比，添加钠基膨润土显著提高了紫花苜蓿根长和芽长(P<0.05)，且随着钠基膨润土添加水平的增加而呈线性增加趋势。与对照组相比，75 mg·kg-1有机砷暴露下，膨润土各处理水平组紫花苜蓿根长和芽长均无显著差异，而150 mg·kg-1有机砷暴露下，各膨润土组显著降低(P<0.05)。表明，随着有机砷暴露水平增加，钠基膨润土的钝化效果降低。

表3 典型有机砷暴露下钠基膨润土对紫花苜蓿根长和芽长的影响Table 3 Effects of Na-bentonite on root length and shoot length of Alfalfa exposed to typical organic arsenic

由表4可知，有机砷暴露可显著降低紫花苜蓿种子发芽率、发芽指数和活力指数，添加钙基膨润土能够降低有机砷暴露对紫花苜蓿种子萌发的不利影响。与75 mg·kg-1和150 mg·kg-1有机砷组相比，添加0.5%，1.0%和3.0%钙基膨润土组紫花苜蓿种子发芽率分别提高了9.45%，9.81%，12.65%和21.09%，39.25%，42.26%；与150 mg·kg-1有机砷组相比，添加1.0%和3.0%钙基膨润土组种子发芽指数显著升高(P<0.05)，3.0%钙基膨润土组种子活力指数显著升高(P<0.05)。

表4 典型有机砷暴露下钙基膨润土对紫花苜蓿种子发芽率、发芽指数和活力指数的影响Table 4 Effects of Ca-bentonite on seed germination percentage,germination index and vigor index of Alfalfa exposed to typical organic arsenic

由表5可知，与对照组相比，75 mg·kg-1和150 mg·kg-1有机砷暴露组均显著降低紫花苜蓿根长和芽长(P<0.05)，且随着有机砷暴露水平增加，紫花苜蓿芽长呈显著降低趋势(P<0.05)。与砷暴露组相比，添加钙基膨润土各组紫花苜蓿根长和芽长显著增加(P<0.05)，并呈现不同程度的剂量效应。

表5 典型有机砷暴露下钙基膨润土对紫花苜蓿根长和芽长的影响Table 5 Effects of Ca-bentonite on root length and shoot length of Alfalfa exposed to typical organic arsenic

2.2 膨润土对有机砷暴露下紫花苜蓿砷积累的影响

由图1可知，有机砷暴露显著增加了紫花苜蓿根和地上部砷的积累，且随着有机砷暴露水平增加而增加(P<0.05)。钝化剂膨润土的加入能够降低砷向紫花苜蓿的迁移，与有机砷暴露组相比，钠基膨润土各组紫花苜蓿根部和地上部砷含量显著下降(P<0.05)；在相同有机砷暴露水平下，紫花苜蓿根部和地上部砷含量均是随着钠基膨润土添加水平增加而降低；无论是低有机砷或高有机砷暴露组，在钠基膨润土添加水平为1%时对砷有较好的钝化效果，随着继续增加钠基膨润土水平，砷迁移变化不大。

图1 钠基膨润土对有机砷胁迫紫花苜蓿根和地上 部砷积累的影响Fig.1 Effect of Na-bentonite on arsenic accumulation in roots and shoots of Alfalfa exposed to organic arsenic注：同色柱子上标字母不同者表示差异显著(P<0.05)，下同Note：Different letters within the same color column indicate significant difference at the 0.05 level,the same as below

由图2可知，添加钙基膨润土可显著降低砷向紫花苜蓿根和地上部的迁移(P<0.05)。与有机砷暴露组相比，0.5%,1.0%和3.0%钙基膨润土组紫花苜蓿根和地上部砷含量均显著降低(P<0.05)，且随着钙基膨润土添加水平增加，根和地上部砷含量呈下降趋势，其中，1.0%和3.0%钙基膨润土组根中砷含量显著低于0.5%水平组(P<0.05)，但各膨润土处理组地上部砷含量无显著差异。

图2 钙基膨润土对有机砷胁迫紫花苜蓿根和地上 部砷积累的影响Fig.2 Effect of Ca-bentonite on arsenic accumulation in roots and shoots of Alfalfa exposed to organic arsenic

表6为两种膨润土对有机砷暴露的钝化修复效应比较，结果可知，在有机砷暴露下，钠基膨润土对紫花苜蓿种子发芽率、发芽指数、活力指数、根长和芽长的促进作用均不同程度优于钙基膨润土，两者间无显著性差异。根部和地上部砷积累量分析可知，钠基膨润土较钙基膨润土不同程度降低了砷向紫花苜蓿的迁移，两者差异不显著。

3 讨论与结论

3.1 有机砷暴露对紫花苜蓿种子萌发和砷积累的影响

种子萌发状况可直接影响幼苗的生长及后期生物量，研究重金属对种子萌发的影响具有重要意义。目前，砷对种子萌发的影响多集中在水稻、小麦、大豆等农作物[20-21]，而对紫花苜蓿等牧草种子萌发的影响研究较少，尤其是关于有机砷污染研究尚未见报道。本试验通过模拟畜禽养殖过程中主要砷源阿散酸污染表明，当阿散酸污染水平在75 mg·kg-1或150 mg·kg-1时均可显著降低紫花苜蓿种子的发芽率、发芽指数和活力指数，对紫花苜蓿根长和芽长均有显著抑制作用。一般认为，重金属对植物种子萌发和幼苗生长存在一个低浓度的刺激效应和高浓度抑制效应，类金属砷也具有相似作用特点[22]。马琼芳等[13]研究发现，在砷浓度为0～5 mg·kg-1范围内，砷对紫花苜蓿种子萌发具有促进作用，当砷浓度超过5 mg·kg-1，种子发芽指数和活力指数显著降低，砷浓度40 mg·kg-1时发芽率显著降低。与无机砷不同，一般认为有机砷并无毒性，对生物体不会产生毒害作用[23]。但进入土壤环境的有机砷可转化为毒性更强的无机砷形态，从而滞留在土壤中对植物产生毒害[24-25]。研究表明[26]，当土壤阿散酸水平为75 mg·kg-1时，48 h内其降解率可达42.99%，10 d后阿散酸仅剩4.36%。有机砷的降解与起初的暴露水平有关，一般来说，暴露水平越高降解越慢，但一旦开始降解环境中无机砷水平往往很快达到较高水平[27]。就本试验而言，很显然，在紫花苜蓿种子萌发的生理期内，两个阿散酸暴露浓度均使土壤中砷含量达到了抑制水平。从紫花苜蓿砷含量分析也可以看出，与空白土壤相比，有机砷暴露组紫花苜蓿根部和地上部砷含量显著升高，且随着有机砷暴露水平的增加呈显著增加趋势。这表明，暴露在土壤中的有机砷已进行了大量分解，从而以无机砷的形态向植物体迁移。

3.2 膨润土对有机砷污染的修复与钝化效应

施入钝化剂是降低土壤重金属污染生物可给性的重要措施之一，尤其适合于治理大面积中轻度土壤重金属污染[28]。作为无机钝化剂的一种，膨润土单晶结构稳定，不易受自然环境变化而发生显著的结构改变或解离[29]，此外，膨润土具有较大的阳离子交换量、比表面积和较低的渗透性能，是国际上常用的污染物工程屏障材料[30]。本试验研究表明，在典型有机砷暴露下添加膨润土能显著提高紫花苜蓿种子发芽率、发芽指数、活力指数，促进根部和地上部的生长。在低水平有机砷(75 mg·kg-1)污染下，钠基膨润土添加水平以1.0%时，紫花苜蓿种子发芽率、发芽指数和活力指数最高。高水平有机砷(150 mg·kg-1)污染下，需增加钠基膨润土添加才能降低砷的危害，以3.0%添加水平较好；在两个污染水平(75 mg·kg-1和150 mg·kg-1)下，钙基膨润土均表现出随着添加水平的增加而钝化效果呈增加趋势，表现为3.0%添加水平组紫花苜蓿种子发芽率、发芽指数、活力指数、根长和芽长均不同程度优于0.5%和1.0%添加水平。这一结果可能与两种膨润土中蒙脱石含量有关。研究表明，蒙脱石是膨润土中主要的活性成分，其吸附与解吸附主要发生在蒙脱石上，蒙脱石含量对膨润土吸附性能有显著影响[31-32]。因此，就本试验来说，所用钠基膨润土蒙脱石含量≥80%，钙基膨润土≥60%，因此，在相同膨润土添加水平下，钙基膨润土中蒙脱石含量较低，增加添加量一定程度上提高了蒙脱石含量，从而促进了对砷的吸附钝化作用。但从紫花苜蓿根部和地上部砷积累来看，在相同有机砷暴露水平下，两种膨润土均是在1.0%添加水平达到了积累稳定性，随着继续增加膨润土添加量，砷积累量并未显著降低。以上结果表明，蒙脱石含量可能是影响两种膨润土对砷钝化的关键因素，同时，两种膨润土在吸附钝化砷的机制上也可能存在差异。此外，就本试验的实地观察来看，3.0%及以上膨润土添加水平可造成土壤粘结性不同程度增加，从而可能影响种子的萌发。因此，在选用膨润土作为土壤重金属污染的修复剂时应注意添加水平。

总之，从本试验的结果来看，在有机砷或砷暴露的土壤中添加无机钝化剂膨润土能够降低砷对植物的毒害作用，减少砷向植物体的迁移，并以1.0%添加水平较好。但膨润土对砷或有机砷的吸附钝化确切机制尚不清楚，有待进一步研究。