耿元波， 王子腾, 李茹霞

(1.中国科学院地理科学与资源研究所， 北京 100101； 2. 中国科学院大学， 北京 100049)

碳是植物最重要的生命元素之一[1]。自20世纪50年代开始测定植物碳同位素丰度比以来，稳定同位素分析取得了很大的进展，很多学者投入到植物碳同位素的研究中[2-6]。目前，植物稳定碳同位素组成(δ13C)不仅用于植物生理生态和土壤-植物-大气系统碳循环的研究，还被广泛应用于气候变化的研究[7-9],因此，对植物稳定碳同位素的研究已经成为全球变化研究的一个重要内容[10,11]。随着研究的深入，稳定碳同位素技术逐渐被用于研究植物-土壤系统碳循环[12-14]、植物体与环境的关系[15-17]，植物群落的动态变化[18]、土壤呼吸的动态变化及区分[19-21]、净生态系统碳交换的区分[22-23]等领域。

C3植物净初级生产力约占陆地生态系统的80%[24]，C3植物比C4植物亏损更多的13C[25]，C3植物的δ13C值介于-35‰～-20‰之间，平均为-27‰，C4植物的δ13C值介于-15‰～-7‰之间，平均为-13‰[26-27]，利用C3和C4植物的δ13C差异，在C3和C4植物季节性转换的植被区，或者将C3和C4植物轮作，可以区分土壤呼吸和生态系统呼吸。Craig[28]于1953年首次报道了C3植物非光合组织(如根、茎等)与叶片相比存在13C富集的现象，Badeck等[29]发现C3植物根和茎与叶片相比分别存在约1.1‰和1.9‰的13C富集，Wu[30]等人用13C脉冲标记技术来示踪碳在根系以及根与土壤间的释放，了解C3植物非光合组织的13C富集状态将有助于在全球尺度上更好地利用13C来研究植物和生态系统。

植物δ13C能够反映植物生长时期的环境状况(如温度、湿度、降水等)[31]，综合体现植物光合作用过程中气孔的传导和CO2的固定，可以作为植物环境中生理机能变化的指标，用于研究植物生理与生态环境间的关系[32]。一般认为植物叶片δ13C值主要受植物本身遗传因素、温度、水分、相对湿度、光照与海拔等因素影响[33-35]，存在明显的时空变异特征[36]，因此植物叶片δ13C可以一定程度反映小生境的环境特征，指示生态适应策略。研究表明，在植物生长季，水分和温度是影响植物生长发育的重要环境因子，也是决定干旱半干旱环境下植物δ13C变化的关键因子[37-38]。草地生态系统是陆地生态系统最重要的组分之一，并具有对气候变化敏感、碳收支年际波动大的特点，在全球循环和气候变化过程中发挥重要作用[39-40]。

内蒙古羊草(Leymuschinensis)草原是我国半干旱区最具代表性和典型性的典型草原亚类之一,是研究草原植被对全球气候变化响应的典型地带[41]。目前，针对内蒙古羊草草原碳同位素组成的研究较少，本研究在内蒙古锡林河流域羊草草原的生长季，应用13C脉冲标记法，探讨了羊草草原地上部活体和地下部活根中稳定碳同位素的组成，分析了水分、温度对羊草草原活体和活根中δ13C的影响，研究结果有助于了解气候因子对植物中稳定碳同位素的影响过程和机理，也可为全球气候变化背景下草原植被稳定碳同位素的组成和变化提供可资参考的科研资料。

1 材料与方法

1.1 研究地点概况

研究地点位于内蒙古锡林浩特市白音锡勒牧场中国科学院内蒙古草原生态系统定位研究站设置的羊草99样地内(43°32′ N，116°40′ E)，海拔约1 200 m。该地区属半干旱温带大陆气候，年平均(1982-2009)气温为0.9℃，年平均(1982-2009)降水量为334 mm，降水主要集中在生长季6～8月[42]。样地内建群种为根茎禾草羊草，优势种包括大针茅(Stipagrandis)和冰草(Agropyroncristatum)等密丛禾草，禾草以外的杂类草大多数是多年生草本植物。牧草在4月中下旬返青，生长期在150～160天左右，7-8月群落平均高度达到40～50 cm，群落覆盖度可达40～50%[43]。土壤类型为钙积干润均腐土(相当于中国土壤地理发生分类中的栗钙土、美国土壤分类系统中的钙积冷凉软土(Calciborolls)[44-45])，土壤质地粘粒平均为21%，砂粒为60%，为砂壤质[46]，土层深度为100～150 cm，土壤有机质厚达20～30 cm。

1.2 研究方法

1.2.1实验设置 在羊草草原99样地中，选取植被情况基本一致(不含糙隐子草(Cleistogenessquarrosa)、猪毛菜(Salsolacollina)、灰绿藜(Chenopodiumglaucum)等C4植物)的样方(50 cm×40 cm)进行13C脉冲标记实验，2011年进行6次实验，2012年进行5次实验，每次实验设置2个处理，分别为标记处理(13C脉冲标记处理)和对照处理(未标记处理)，每个处理5个重复，沿东西向展布，各占一行，对照处理样方布置在标记处理样方的上风向。每次实验样方数目共为10个，各样方间距为3 m。试验于羊草草原生长盛期进行(7-9月)，先将标记箱底座砸入样方土壤中，调至水平，2天后在每一个标记样方中央放置一个小烧杯，烧杯内放300 mg固体Ba13CO3(丰度为98at%)，扣上标记箱(30 cm(高)×40 cm(宽)×50 cm(长))，往底座边槽中加入适量水，保证密封性良好。在烧杯正上方用注射器穿过密封塞(粘在箱体上方开孔处)，向烧杯内加入3 mL略微过量的稀HCl(稀盐酸配置按水酸比为7∶1进行)，确保Ba13CO3反应完全，间隔约20 min打入一次普通CO2气体以促进植物对13CO2气体的吸收，每次注入体积约20 mL。约3 h后标记完成，将标记箱移除(底座留在原处，减小扰动)，让牧草在自然条件下生长。对照样方不做标记处理，植被在自然状态下生长。

1.2.2样品采集、制备、测试和数据分析13C脉标记完成10天后(13C在植物中分配完毕)[47]，采集标记样方及对照样方的地上部活体及地下部根系样品，每次采集时间为上午10点，同时测量此时的气温、15 cm土壤温度(SN2202 型数字测温仪，北京师范大学司南仪器厂)和0～20cm土壤水分。采样间隔约10～15天(遇降雨时，间隔时间稍长)，2011年采集时间为7月12日、7月22日、8月1日、8月13日、8月23日、9月3日；2012年采集时间为7月16日、30日、8月13日、29日、9月9日。标记处理样方和对照处理样方的植物样品按地上部活体和地下部根系分开采集，根系取样深度为0～20 cm，面积为25 cm×25 cm，根系依据比重不同漂洗区分出活根与死根。植物活根与植物地上部活体105℃杀青，70℃烘干，称至恒重，准确测定生物量，测后样品粗碎混匀，四分法缩分取50 g左右用球磨机研磨至200 目，封装常温干燥保存备用。在两个处理各样方中用土钻多点采样分别钻取0～20 cm层次的土壤，土壤样品量约1 kg，取部分样品用烘干法测定土壤水分含量(烘干基)[48]，其余土壤样品碾碎风干四分法缩分取100 g左右用球磨机研磨至200目，封装常温干燥保存备用。活根、地上部活体及土壤样品δ13C(有机碳)值在中科院地理科学与资源研究所测定，测试仪器为德国Finnigan公司MAT 253 稳定同位素质谱仪，δ13C值以VPDB(Vienna Pee Dee Belemnite)为基准校正，分析精密度为0.2‰。

应用SPSS20.0软件进行数据统计分析，Origin Pro 2016软件作图。采用配对样本t检验检验两年间对照处理和标记处理中的地上部植物活体与植物活根δ13C之间是否存在显著差异。回归趋势线及相应参数由Origin Pro 2016软件直接给出，回归因变量δ13C及自变量(土壤水分、气温、地温)使用2年间对应的数据。

2 结果与分析

2.1 羊草草原地上部植物活体和地下部活根δ13C的差异及变化特征

2011年羊草草原植物生长盛期(7-9月)对照处理中地上部植物活体δ13C值介于-25.834‰～-25.076‰之间，2012年(7-9月)介于-28.000‰～-27.000‰之间，年内相差在1‰左右，两年间相差约3‰左右，差异均不大，2年所测的结果均落在Skrzypek等[49]给出的C3植物δ13C值范围-35‰～-20‰之间。2011年13C脉冲标记处理中地上部植物活体δ13C值的变化范围在-13.942‰～16.173‰，2012年为-15.301‰～12.667‰，年内相差在30‰左右，年间相差约31‰，差异较大。标记处理中活体的δ13C均值和变幅都明显大于对照处理(图1、表1)。2011年和2012年对照处理中活根δ13C值的变化范围分别为-24.973‰～-23.612‰和-25.969‰～-25.005‰，年内变幅在1‰ 左右，年间变幅约2%，均比较小。2011年13C脉冲标记处理中活根δ13C值在-23.141‰～-16.332‰之间变动，2012年在-24.140‰～-21.746‰之间，2011年内变幅约为7‰，2012年约为3‰，年间变幅约为8%，变差均较大。在整个2年的观测期间标记处理中活根的δ13C均值和变幅都明显大于对照处理，活体(图1-A,B)与活根(图1-C,D)在两个处理中的δ13C值随时间的变化趋势基本一致，标记与否不影响活体和活根δ13C的变化趋势，13C脉冲标记技术的应用放大了活体与活根δ13C值在生长期内的变化(图1、表1)

图1 2011、2012年羊草草原标记处理与对照处理中活体(A,B)和活根(C,D)的δ13C值(误差线：均值±标准偏差,n=5)Fig.1 The δ13C of the shoots(A,B)and the living roots(C,D)in the labeled treatments and control treatments in 2011 and 2012 (Error bars:Mean±S,n=5)

表1 2011和2012年对照处理和标记处理中活体与活根δ13C值Table 1 The δ13C of the shoots and the living roots in control treatments and labeled treatments in 2011 and 2012 / ‰

时间Year处理Treatment活体shoots活根living roots最小值Min最大值Max平均值Mean最小值Min最大值 Max平均值 Mean2011对照处理(n=30)Control-25.83-25.08-25.62±0.45-24.97-23.61-24.47±0.69标记处理(n=30)Label-13.9416.17-1.01±10.17-23.14-16.33-20.81±2.352012对照处理(n=25)control-28.00-27.00-27.42±0.43-25.97-25.01-25.56±0.39标记处理(n=25)label-15.3012.67-5.58±11.11-24.14-21.75-21.32±0.91

由图2可以看出，在2011和2012年的生长盛期内，对照处理(图2-A,B)及标记处理(图2-C,D)中活体和活根的δ13C值随时间的变化势均表现出良好的一致性，表现为随时间的推移，活体和活根的δ13C值先减小再增加，随后再减小。在对照处理中活体及活根δ13C值的变幅都不大，而标记处理中则要大得多。在对照处理中(图2-A,B)，活根相对于活体更容易富集13C,并且活体与活根δ13C在同一时期出现峰值，即8月中下旬，此时活体与活根中13C积累量达到最大，对照处理中活体δ13C显著小于活根δ13C。经13C脉冲标记处理后(图2-C,D)，活体更容易累积13C，活体δ13C显著大于活根δ13C，并且活体的δ13C值的变幅也较活根δ13C的变幅大，活体δ13C值分布在-15‰～16‰，活根的δ13C分布在-24‰～-16‰(图2，表1)。

图2 2011和2012年活体和活根在对照处理(A,B)及标记处理(C,D)的δ13C值(误差线：均值±标准偏差n=5)Fig. 2 The δ13C of shoots and living roots for control treatments (A,B) and13C labelled treatments (C,D) in 2011 and 2012.(Error bars:Mean±S,n=5)

2.2 水分和温度对羊草草原地上部活体和地下部活根δ13C值的影响

2.2.1土壤水分对羊草草原活体和活根δ13C值的影响 一般情况下，C3植物δ13C值随着降雨量或土壤水分的减少而增大，原因在于C3植物光合作用过程中，碳同位素的分馏强度与ci/ca(ci和ca分别是叶片细胞间CO2浓度和大气CO2浓度)正相关，当受到干旱胁迫时，植物为了避免水分蒸发而降低气孔导度，使得ci/ca值变小，继而导致植物δ13C增大[3,50-52]，本次研究结果也支持这一点。在对照处理中(图3-A)，地上部活体δ13C值与0～20 cm土壤水分含量之间存在显著的负相关关系，土壤水分变化可以解释δ13C变化的62%(R2=0.6152,P<0.05)，土壤水分含量每增加1%，羊草活体δ13C降低约0.1‰。与活体一致，对照处理的地下部活根δ13C值与0～20 cm土壤水分含量之间也具有显著负相关关系，土壤水分变化可以解释δ13C变化的72%(R2=0.7229，P<0.05)，土壤水分含量每增加1%，活根δ13C降低约0.1‰(图3-B)。

13C脉冲标记后(图4-A)，标记处理的活体δ13C与0～20 cm土壤水分之间存在显著的二次函数关系，土壤水分的变化可以解释活体δ13C值相应变化的80%(R2=0.8039,P<0.05)，抛物线的拐点对应的土壤水分值为W20=12.56%，此拐点反应植物的最佳水分利用效率。如图4-B，标记处理的活根δ13C与0～20 cm土壤水分含量之间具有线性负相关关系，土壤水分的变化可以解释活体δ13C值相应变化的44%(R2=0.4407,P<0.05)，土壤水分含量每增加1%，活根δ13C降低0.15‰，通过13C脉冲标记，使活根δ13C随土壤水分变化更加显著，由降低0.1‰增加到降低0.15‰，变化更加明显。

图3 对照处理中活体δ13C(A)和活根(B)与0～20 cm土壤水分的线性回归图(误差线：均值±标准偏差,n=5)Fig. 3 The linear regression graph of soil moisture content in 0～20cm depth with δ13C of the shoots (A) and living roots (B) in control treatments.(Error bars:Mean±S,n=5)

图4 标记处理中活体(A)和活根(B)中δ13C与0～20 cm土壤水分含量的回归图(误差线：均值±标准偏差,n=5)Fig. 4 The regression graph of soil moisture content in 0～20 cm depth with the δ13C of the shoots (A) and living roots (B) in13C labeled treatment.(Error bars:Mean±S,n=5)

2.2.2温度对羊草草原地上部活体和地下部活根δ13C值的影响 温度是影响植物δ13C的重要气候因子，它一方面直接影响光合碳同化过程中的一系列酶促反应，从而对植物碳同位素分馏产生影响[53]；另一方面，它也间接影响呼吸速率及气孔对水分和CO2的扩散阻力，从而导致气孔导度(gs)和ci/ca值的变化，进而影响碳同位素分馏，最终对植物的碳同位素组成发生作用[51-52,54]。

从图5可以看出，对照处理(A)和标记处理(B)中羊草草原地上部活体δ13C与气温呈正相关关系，随着气温的升高，羊草草原地上部活体δ13C增大。A中气温每升高1℃，活体δ13C增加0.19‰，气温变化可解释活体δ13C变化的74%，B中气温每升高1℃，标记的地上部活体δ13C增加1.57‰，气温变化可解释活体δ13C变化的43%，13C标记放大了活体δ13C随气温变化的幅度。从决定系数看，自然状态下(对照)温度的变化对δ13C的影响要大于标记处理。

图5 气温与对照处理活体δ13C(A)和标记处理活体δ13C(B)的线性回归图(误差线：均值±标准偏差,n=5)Fig. 5 The linear regression graph of the air temperature with the δ13C of the shoots in control treatments

(A) and the13C labeled treatments (B) (Error bars:Mean±S,n=5)

两处理中，羊草草原15 cm地温与0-20 cm活根的δ13C均呈显著的线性正相关关系(图6)，即随着15 cm地温的升高，羊草草原地下部活根δ13C增大。如图6-A，对照处理中土壤温度变化可解释活根δ13C变化的64%(R2=0.6427,P<0.05)，15 cm地温每升高1℃,对照组活根δ13C增大约0.19‰，标记处理中(图6-B)土壤温度变化可解释活根δ13C变化的51%(R2=0.5122,P<0.05)，15cm地温每升高1℃，地下部活根δ13C增加0.59‰。与活体类似，自然状态下土壤温度变化对δ13C的影响要大于标记处理。

对照处理中，气温对活体δ13C值的影响与15 cm地温对活根δ13C的影响是一致的，即温度每升高1℃，活体与活根中δ13C增加约0.19‰，而标记处理中，活体与活根中δ13C随温度的增幅都大于对照处理，气温对活体δ13C增幅的作用最大，单位温度变化使δ13C增加约1.57‰。

图6 15 cm地温与对照处理中活根(A)和标记处理中活根(B)的线性回归图(误差线：均值±标准偏差,n=5)Fig.6 The linear regression graph of the 0～15 cm soil temperature with the δ13C of the living roots in control treatments (A) and in13C labeled treatments (B) (Error bars:Mean±S)

3 讨论

生长季是植物生长发育的重要时期，也是植物各种代谢活动的旺盛期。在生长旺季研究羊草草原植被中13C的组成，可以使我们更好地理解C在植物体系中的分配。本实验通过13C脉冲标记处理和未标记对照处理探讨了13C在羊草草原不同组分中的分配和变化情况以及水分和温度对羊草草原13C分配的影响。

Cernusak等人[55]阐述了C3植物非光合组织(比如根、茎)与植物叶片富集13C的情况，指出相对于植物叶片，茎和根会更趋向于富集13C，并且在不同植物中富集程度不同。本试验对照处理中，2011年活根中δ13C为-24.470‰，活体中δ13C为-25.619‰，活根δ13C比活体高1.149‰；2012年，羊草草原活根中δ13C为-25.560‰，活体中δ13C为-27.420‰，活根比活体高1.860‰。此结论表明研究区羊草草原地下部草本植物活根中13C要比地上部植物活体富集1～2‰，与Badeck等[29]人研究结果相似，他们认为植物根相比地上活体也富集13C，δ13C平均比叶片高1.1‰。

植物叶片的碳同位素组成(δ13C值)是植物叶片组织合成过程中光合活动的整合，可以反应一定时间内植物水分散失和碳收获之间的相对关系[35]。研究表明，C3植物的δ13C值易受降雨量和温度的影响，其叶片δ13C值随降雨量和温度的升高而显著降低[56]。通常情况下，C3植物中δ13C值随着降水量或土壤水分的增加而减小[3,50]，也有一些研究观测到少量C3植物δ13C值随着降雨量或土壤水分的增加而增加的现象[5,49,57]。在内蒙古半干旱草原区，土壤水分主要受降水的影响，与降水量正相关。本试验中，对照处理的活体和活根δ13C与0～20 cm土壤水分含量之间存在显著的负相关性，标记处理的活根δ13C与0～20 cm土壤水分含量也具有显著负相关性，即随着0～20 cm土壤水分的增加，对照处理的活体和活根及标记处理的活根δ13C值都在减小。对于受13C脉冲标记影响较大的活体来说，标记处理中活体δ13C与0～20 cm土壤水分之间存在二次函数关系(R2=0.8039,P<0.05)，在土壤水分含量较低时，植物活体δ13C随土壤水分含量的增加而增加，在土壤水分含量较高时随土壤水分含量的增加而减小，表明外部大气中13C含量较高时，土壤水分对地表草本植物活体中稳定碳同位素分馏效应的影响存在明显的拐点[49-50,57]。

植物体内碳同位素的分馏主要发生在光合过程中，因此除水分因素外，温度也是影响植物δ13C的重要因子。本实验中，对照处理及标记处理中羊草草原植物的活体、活根δ13C与温度均呈显著正相关关系，地上部活体考虑气温的影响，地下部活根考虑地温的影响，即随着气温和地温的升高，活体、活根δ13C均增大。这可能是由于随着气温及地温的不断升高，植物为避免水分过量蒸发，从而关闭部分气孔，致使气孔导度降低，ci/ca值减小，C3植物的碳同位素分馏程度相应降低，因此植物δ13C增加[35]。

4 结论

通过两年的野外试验，发现：13C脉冲标记处理和对照处理中活体和活根的δ13C值随时间的变化趋势呈良好的一致性；在高含量13C空气中活体比活根更容易累积13C，标记处理使δ13C值随时间变化的趋势更加明显。对照处理的活体和活根及标记处理的活根中，δ13C与0～20 cm土壤水分存在负相关关系，标记处理的活体中δ13C与0～20 cm土壤水分之间存在二次函数关系。两处理中，温度与活体(气温)和活根(地温)δ13C均呈正相关关系；对照处理中，气温对活体的影响与15cm地温对活根的影响是一致的，即温度每升高1℃，活体与活根中δ13C增加约0.19‰。经过13C脉冲标记，将δ13C的变化量放大，变化规律更加显著，其中气温对活体的影响较大，单位温度变化会使活体δ13C变化1.57‰。