李 波， 方志坚， 张英俊， 李 红， 刘璎辉， 王玉珏， 张延琦

(1.齐齐哈尔大学生命科学与农林学院， 抗性基因工程与寒地生物多样性保护黑龙江省重点实验室， 黑龙江 齐齐哈尔 161006； 2. 中国农业大学动物科学技术学院， 北京 100193；3. 黑龙江省农业科学院畜牧兽医分院, 黑龙江 齐齐哈尔 161005)

紫花苜蓿(MedicagosativaL.)是多年生饲用豆科植物之一，具有丰产潜力大，营养价值高，适应性广等特点，故被誉为“牧草之王”[1-2]。同时，苜蓿具有抗逆性强、耐瘠薄等特点，因此常用于改良土壤、改善生态环境等[3]。盐害是限制苜蓿能否大面积种植的关键因素之一，苜蓿的耐盐机制由特定基因型决定，且随分化水平的变化而变化[4]。苜蓿生长发育过程中会受到不同程度的盐碱胁迫，其中种子萌发期是植物盐害最敏感时期，植株长势是否优良取决于不同苜蓿品种间盐敏感性差异，因此许多学者更加注重耐盐苜蓿种质资源的筛选和优良品种的选育[5-7]。本文以5份龙牧系列苜蓿种质资源为材料，并对其进行不同浓度的混合苏打盐碱胁迫，分析各苜蓿品种萌发指标和芽苗指标的变化，同时运用主成分分析和模糊数学隶属函数分析法进行综合评价，建立苜蓿萌发期耐盐碱综合评价体系，为苜蓿耐盐品种的选育、改良盐碱化土地、提供优质蛋白饲料和盐碱地畜牧业的发展提供帮助。

1 材料与方法

1.1 试验材料

苜蓿龙牧系列种子由黑龙江省畜牧研究所提供，苜蓿品种、编号及拉丁名见表1。

1.2 试验方法

挑选籽粒饱满且均匀的5种苜蓿种子，用蒸馏水浸泡2 h，将其置于铺有2层滤纸的发芽盒(12 cm ×12 cm)中，每盒50粒种子，加入20 mL不同浓度混合苏打盐碱溶液，以蒸馏水培养的种子作为对照，重复3次，将发芽盒置于HPG-280BX光照培养箱中，培养温度为25℃，恒重法进行每天补水，以保持发芽盒内苏打盐碱浓度不变。

混合苏打盐碱浓度：以NaHCO3和Na2CO3两种盐碱9∶1混合，设置苏打盐碱浓度为10，20，30，40，50和55 mmol·L-1，相对应的pH分别为8.46，8.34，8.29，8.19，8.16和8.14。

种子萌发7 d后，将5种苜蓿的芽苗的地上部分和地下部分，取10株具代表性的芽苗，用游标卡尺分别测量它们的根长和芽长。将芽苗取出，挑选出10株具有代表性的芽苗，用吸水纸吸干芽苗上的水分后，立即称重即为鲜重(Fresh weight，FW)，将上述以测量过鲜重(FW)的芽苗放入80℃烘箱，烘干至恒重，即为干重(Dry weight，DW)。

表1 5种苜蓿品种编号、审定年份及拉丁名Table 1 5 alfalfa variety number,approved year and Latin names

1.3 测定指标

种子萌发期间，每天计算种子的发芽数，各指标测定公式[8-10]如下：

种子发芽率(Germination rate，GR)=发芽种子数/种子总数×100%；

种子发芽势(Germination potential，GP)=第三天发芽种子数/供试种子数×100%；

发芽指数(Germination index，GI) = ΣGt/Dt×100%(Dt为发芽日数，Gt为Dt相对应的每天发芽种子数与发芽日数)；

活力指数(Vigor index，VI)=发芽指数(GI)×胚根长(RL)；

胚芽长(Embryo length，EL)=(L1+L2+L3+……+L10)/10；

胚根长(Radicle length，RL)=(L1+L2+L3+……+L10)/10；

鲜重(FW)=(F1+F2+F3+……+F10)/10；

干重(DW)=(D1+D2+D3+……+D10)/10；

含水量(Water content，WC)=苜蓿鲜重(FW)-苜蓿干重(DW)。

1.4 耐盐性评价及分析

耐盐系数=(不同苏打盐碱浓度处理下平均测定值/对照组测定值)×100%

数据标准化：

隶属度的计算[11]：对测得数据进行用模糊数学隶属度公式进行转换，隶属函数公式为：

U(Xijk)=(Xijk-Xmin)/(Xmax-Xmin)

(1)

公式中，U(Xijk)、U′(Xijk) 为第i个品种第j个胁迫浓度的k项指标的隶属度，Xmin、Xmax分别为k项指标的最小值和最大值。

权重和综合评价D值[12]的确定：

采用标准差系数法，用公式(2)计算标准差系数Vj，经公式(3)归一化后得到各指标的权重系数Wj。

Vj=[Σ(Xij- (Xij)2]1/2/Xij

(2)

Wj=Vj/ΣVj

(3)

种质耐盐综合评价D值的计算公式为：D=∑(Xij×Wj)

1.5 数据处理

采用SPSS 21.0统计学软件进行显著性分析和主成分分析，用Excel 2007对数据进行计算。

2 结果与分析

2.1 苏打盐碱对苜蓿种子发芽率和发芽势的影响

5种龙牧苜蓿种子随混合苏打盐碱胁迫浓度的增加，发芽率均呈下降的变化趋势(表1)，浓度为55 mmol·L-1时，5种苜蓿种子的发芽率均为0，说明此浓度完全抑制了苜蓿种子的萌发。低浓度(10 mmol·L-1)与对照组相比差异不显著(P>0.05)，随着苏打盐碱浓度的增加，LM801和LM803种子的发芽率出现显著的抑制作用，在30 mmol·L-1苏打盐碱浓度下，LM806，LM807和LM808种子的发芽率高达50%以上，从发芽率的变化分析，LM806，LM807和LM808苜蓿对苏打盐碱的抗性高于LM801和LM803苜蓿。

5种龙牧苜蓿种子随苏打盐碱胁迫浓度的增加，发芽势均呈下降的变化趋势(表1)，低浓度(10 mmol·L-1)与对照组相比差异不显著(P>0.05)，随着苏打盐碱浓度的增加，LM801，LM803和LM806种子的发芽势出现显著的抑制作用，在30 mmol·L-1苏打盐碱胁迫下，LM807和LM808种子的发芽率高达60%以上，从发芽势的变化分析，LM807和LM808苜蓿对苏打盐碱的抗性高于LM801，LM803 和LM806苜蓿。

表1 混合苏打盐碱胁迫下种子发芽率和发芽势Table 1 Seed germination rate and germination potential under mixed soda saline-alkali stress

注：同列不同小写字母表示胁迫浓度间在0.05水平差异显著;“-”代表在胁迫处理下种子未萌发，下同

Note:Different lowercase letters in column show significant different among stress concentration at the 0.05 level;“-”indicates no germinate of seed under stress treatment,the same as below

2.2 苏打盐碱对苜蓿种子发芽指数和活力指数的影响

5种龙牧种子随苏打盐碱胁迫浓度的增加，发芽指数均呈下降的变化趋势(表2)，与对照比较低浓度(10 mmol·L-1)对LM803，LM807苜蓿种子发芽指数影响不大，对LM801，LM806 和LM808发芽指数的影响比较大，随着苏打盐碱浓度的增加，LM801，LM803和LM806种子的发芽势出现显著的抑制作用，在30 mmol·L-1苏打盐碱浓度下，LM807和LM808种子的发芽指数高达50%以上，从发芽指数的变化分析，LM807和LM808苜蓿对苏打盐碱的抗性高于LM801，LM803和LM806苜蓿。

除LM807苜蓿外，4种龙牧种子随苏打盐碱浓度的增加，活力指数均呈下降的变化趋势(表2)，与对照比较低浓度(10 mmol·L-1)对LM806，LM808苜蓿种子发芽指数影响比较大，对LM801，LM803 和LM808的活力指数影响不大，随着苏打盐碱浓度的增加，LM801，LM803和LM806种子的活力指数出现显著的抑制作用，在30 mmol·L-1苏打盐碱胁迫下，LM807和LM808种子的活力指数高达500以上，从活力指数的变化分析，LM807和LM808苜蓿对苏打盐碱的抗性高于LM801，LM803 和LM806苜蓿。

表2 混合苏打盐碱胁迫下种子发芽指数和活力指数Table 2 Seed germination index (GI) and vigor index (VI) under mixed soda-alkali stress

2.3 苏打盐碱对苜蓿种子芽苗生长的影响

除LM803苜蓿外，4种龙牧种子随苏打盐碱胁迫浓度的增加，芽苗的胚芽长均呈增加的变化趋势(表3)，与对照比较低浓度(10 mmol·L-1)促进芽苗的生长，在30 mmol·L-1苏打盐碱胁迫下，5种龙牧种子的胚芽长均受到不同程度的抑制；除LM803和LM808苜蓿外，LM801，LM806 和LM807 种子随混合苏打盐碱浓度的增加，芽苗的胚根长均呈增加的变化趋势(表3)，与对照比较低浓度(10 mmol·L-1)促进芽苗胚根的生长，在30 mmol·L-1苏打盐碱胁迫下，5种龙牧种子的胚根长均受到强烈的抑制生长，在40和50 mmol·L-1盐碱浓度下完全抑制芽苗的生长，培养7 d时，胚芽停止生长甚至坏死，说明其芽苗期对苏打盐碱比较敏感。

表3 混合苏打盐碱胁迫下种子的胚芽长和胚根长Table 3 Embryo length (EL) and radical length (RL) under mixed soda-alkali stress

2.4 苏打盐碱对苜蓿种子的芽苗鲜重、干重和含水量的影响

由表4可知，LM801，LM806和LM807鲜重和干重均随苏打盐碱浓度的增加而呈现先增加后降低的变化趋势，说明苏打盐碱浓度为10 mmol·L-1时促进植株对水和无机盐离子的运输和吸收，而LM808的鲜重和干重随盐碱浓度的增加而呈现下降的变化趋势，苏打盐碱浓度低于40 mmol·L-1时，仅LM807还存在一定的芽苗。

除LM808的芽苗含水量外，4种苜蓿芽苗的含水量均随苏打盐碱浓度的增加而呈现先增加后下降的变化趋势(表4)，由于品种间的差异和不同浓度的盐碱胁迫形成的渗透势不同，各品种含水量的变化幅度也不同。苏打盐碱浓度为10 mmol·L-1时，LM807表现出较强的吸水能力来维持自身生长发育所需要的水分，其余各品种吸水能力较差，自身生长受到明显抑制。

表4 混合苏打盐碱胁迫下的苜蓿芽苗鲜重、干重和含水量Table 4 Fresh weight,dry weight and water content of alfalfa buds and seedlings under mixed soda saline-alkali stress

2.5 对芽苗期各指标进行主成分分析

主成分的特征值和贡献率是选择主成分的重要依据，由表5知，在测定的9个发芽指标和芽苗生长指标中，前2个主成分反映了总信息量的90.172%，特征值总和达到8.115，表明这两个主成分基本上能反映苜蓿抗苏打盐碱能力。

表5 各指标主成分分析的特征值和方差贡献率Table 5 Characteristic value and variance contribution rate of principal component analysis of each index

通过对9个指标主成分分析矩阵的计算，获得了各指标贡献大小的特征向量见表6，主成分分析共得到2个主成分，主成分1中VI，GR，GI，GP，RL具有较大正载荷值，DW和EL载荷值次之，而FW和WC具有负载荷值，表明主成分1主要反映了VI，GR，GI，GP，RL等指标，主成分2中FW，WC具有较大正载荷值，EL，DW，RL载荷值次之，即主成分2主要反映FW，WC等指标。

表6 各指标主成分分析矩阵和特征向量Table 6 Principal component analysis matrix and eigenvector of indicators

注：GR，GP，GI，VI，DW，FW，WC，EL和RL分别代表发芽率、发芽势、发芽指数、活力指数、干重、鲜重、胚芽长、胚根长

Note：GR，GP，GI，VI，DW，FW，WC，EL and RL respresent germination rate，germination potential，germination index，vigor index，dry weight，fresh weight，water content，embryo length and radicle length,respectively

2.6 对芽苗期各指标进行隶属函数、权重系数及D值综合分析

根据主成分分析结果，特征向量表示各单独指标对总指标的贡献大小，挑选主成分中特征向量大于0.16的各指标，主要有GR，GP，GI，VI，FW，WC，EL，采用隶属函数和权重系数(Wj)对5苜蓿种子萌发期的7项指标进行综合分析。结果如表7，各品种耐盐性由强到弱依次为：LM807>LM808>LM806>LM803>LM801。

表7 各指标隶属值、权重系数、综合评价D值Table 7 The membership function value,weight coefficient and comprehensive evaluation D value of each index

3 讨论

苜蓿种子在不同的盐碱条件下萌发率高低是其能否在盐碱环境中生存的基础[13]。但一项指标无法全面无误地反映品种耐盐碱性萌发的强弱，所以选取发芽率等多项指标数据进行综合分析，来分析在种子萌发期耐盐的品种[14]。萌发率能直接的反应种子耐盐碱胁迫的基础，研究结果与古丽内尔·亚森等[15]人的研究成果一致，盐生植物在低盐度和蒸馏水中的种子萌发率没有显著的差异，但是随着盐度的增高，其萌发率下降。其中种子活力指数既能反映种子的发芽率，又能客观反映种子的萌发质量[16]。种子这4项数据同时保持较高的值，才能证明种子能快速、整齐的萌发，并保持幼苗的粗壮。

从根长、芽长、鲜重、干重、含水量上分析，在低浓度胁迫下根的生长发育受到促进作用，使根系能够保持相对高于对照组根系的活力，维持高水平的吸收、运输等功能，增加根的吸水能力，营养物质的运输，使快速的发育、伸长；高浓度的盐碱胁迫下，苜蓿幼苗生长缓慢，有的开始衰亡、腐烂，这与王素平等[17]人的实验结果相似，植物根系总吸收面积受到一定抑制、质膜透性升高并伴随吸水能力下降，使叶片相对含水量下降，从而导致光合速率降低，盐胁迫对植株的伤害加重[18-19]。

通过主成分分析可知，GR，GP，GI，VI，FW，WC，EL等指标可以较好得反映龙牧苜蓿品种的抗盐性，利用隶属函数法，赋予7个萌发指标以权重，通过矩阵运算和综合排序可知，LM807的综合D值最高，LM801的综合D值最低，表明龙牧807苜蓿的耐盐碱性最强，龙牧801苜蓿的耐盐碱性最弱，研究结果与田小霞等[20]人对苜蓿属植物苗期耐盐指标筛选及耐盐性综合评价所得到的结果相似，利用D值对龙牧苜蓿种质资源的耐盐性进行综合评价，解决了植物耐盐性评价方法中多个指标之间无法进行统一比较的问题，对龙牧苜蓿种质资源的耐盐碱性予以准确、科学的评价。这与前人在番茄[21]、披碱草[22]、花椰菜[12]等植物耐盐性评价中的发现类似，这种综合评价体系的构建为耐盐碱性优质牧草的选育提供一定依据。

4 结 论

5种龙牧苜蓿种子在混合苏打盐碱胁迫下，低浓度(10 mmol·L-1)对种子的发芽率、发芽势、活力指数和发芽指数影响比较小，对芽苗的生长表现出一定的促进作用，而在苏打盐碱浓度超过30 mmol·L-1时，对种子的萌发和芽苗的生长产生了明显的抑制作用。5种龙牧苜蓿种质资源的耐盐碱性由高到低依次为：龙牧807苜蓿>龙牧808苜蓿>龙牧806苜蓿>龙牧803苜蓿>龙牧801苜蓿，为苏打盐碱地选择适种苜蓿品种提供一定的科学依据。