侯静静， 李葆春， 汪军成， 姚立蓉， 边秀秀， 胡 娜， 司二静， 杨 轲， 孟亚雄， 马小乐， 王化俊 *

(1. 甘肃省干旱生境作物学重点实验室/甘肃省作物遗传改良与种质创新重点实验室， 甘肃 兰州 730070； 2. 甘肃农业大学农学院， 甘肃 兰州 730070；3. 甘肃农业大学生命科学技术学院， 甘肃 兰州 730070)

近年来土壤污染问题日益突出，据报道，我国次生盐渍化的土壤面积为7 700 万hm2，占到农业土壤总面积的30%以上，并呈逐年增加的趋势[2]。受重金属污染的土壤大约有2 000 万hm2，占全国农田总面积的1/6，每年大约有1 200 万吨粮食受不同程度的重金属污染，合计经济损失至少达200 亿元[3]。重金属和次生盐渍化复合污染的加重，除了自然因素，主要是由于盲目过度施肥与灌溉，引起土壤板结、酸化、次生盐渍化等问题加剧了重金属的迁移性[4-5]，且重金属具有生物累积性，不能被生物体降解，积累在土壤中的重金属通过食物链在动植物以及人体内富集[6-7]。

重金属污染盐渍化土地的改良问题迫在眉睫，植物修复技术是指通过植物生命活动将土壤中重金属提取、吸收、转化、分解或固定，从而减少土壤中有害重金属污染，具有成本低廉、操作简便、二次污染易控制、处理效果好且能大面积推广应用等优点，其机理研究及应用前景备受关注[8]。植物修复的基础和关键是培育筛选出重金属富集能力较强的植物[9]。盐生草(Halogetonglomeratus)是中央种子目(Centrospermae)，藜科(Chenopodiaceae)，一年生草本植物。主要分布于甘肃、青海、新疆及西藏等地[10]，具有较强的抗旱耐盐碱地特性，其盐分叶片区隔化和根系的限制性吸收是盐生草最主要耐盐机制[11]。盐生草在西北地区重金属污染严重的土地上为优势植物种群，所以使用盐生草作为重金属污染盐碱地修复的材料具有重要意义。

有研究表明，在植物生长过程中，种子萌发和早期幼苗生长阶段(防御机制未健全)对金属毒性很敏感，可以将种子的萌发和早期幼苗的生长状况作为毒性试验来测试植物对金属的耐性[12]。鉴于此，本研究首次以西北地区抗旱耐盐碱地的特色盐生植物―盐生草为材料，在模拟盐环境(100 mmol·L-1NaCl)下进行重金属Cu2+，Zn2+，Ni2+，Cd2+，Pb2+不同浓度处理的单一胁迫萌发实验，以期为盐生草在重金属污染盐渍化土地植物修复技术中的应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料与试剂

1.1.1试验材料 盐生草种子由甘肃省干旱生境作物学重点实验室—麦类遗传育种实验室提供。

1.1.2试验试剂 75%乙醇溶液；2%次氯酸钠溶液；用去离子水配制浓度C=100 mmol·L-1的NaCl溶液；用CuSO4·5H2O配制含Cu2+溶液的母液；用ZnSO4·7H2O配制含Zn2+溶液的母液；用NiCl2·6H2O配制含Ni2+溶液的母液；用Cd3O12S3·8H2O配制含Cd2+溶液的母液；用PbCl2配制含Pb2+溶液的母液。以上配制母液的溶液均为100 mmol·L-1的NaCl溶液。通过预试验结果，以母液稀释各离子浓度梯度(表1)所示：

表1 试验中配制的不同浓度5种重金属溶液Table 1 Different concentrations of 5 heavy metal solutions in the test

1.2 试验方法

1.2.1种子预处理 选取大小均一饱满的盐生草种子，倒入离心管中，加入75%(v/v)的乙醇，震荡30 s，用移液枪移除上清液；加入去离子水(ddH2O)，震荡后吸除，重复3次；加入2%(v/v)次氯酸钠溶液，震荡1.5 min，移除上清；加入去离子水(ddH2O)，震荡后吸除，重复3次；然后用滤纸将种子上的水吸干[13]。

1.2.2萌发试验 将消毒后的种子均匀放置于铺有双层滤纸的不同离子浓度培养皿发芽床中，培养皿经高压蒸汽灭菌。每盒均匀放入50粒种子，进行不同重金属及浓度处理的萌发实验。每个处理设置3次重复。以浓度C=100 mmol·L-1的NaCl溶液(0.70%含盐量)作为对照，此浓度依据我国土壤盐渍化分级标准，属于中度盐渍化(0.50%～1.00%)，该浓度也为盐生草适宜生长的盐浓度[11]。封口膜密封培养皿，置与温度为20℃，光照时间为16 h(昼)/8 h(夜)，光强1 000 Lx，相对湿度为50%～60%的环境下培养。

1.2.3指标测定方法 发芽势(germination energy，GE)=3 d内发芽种子粒数/种子总粒数×100%，以露白界定为种子萌发[14]；

发芽率(germination rate，GR)=7 d内发芽种子粒数/种子总粒数×100%[15]；

幼苗株高(seedling height，SH)：生长7 d后，采用WinRHIZO根系扫描仪测量；

鲜重(fresh weight，FW)：生长7 d后，去离子水(ddH2O)冲洗材料，滤纸吸干表面水分，用电子分析天平称其质量，以50株计算；

干重(dry weight，DW)：将测完鲜重的材料放置40℃烘箱4 d，取出用电子分析天平称其质量，以50株计算；

离子含量(ion content，IC)：将测完干重的材料研磨至粉末状，采用原子吸收分光光度法进行检测[16]；

根系活力(root activity，RA)：采用2,3,5,-三苯基四唑氯化物(TTC)还原测定法[17]。

1.2.4数据处理 试验采用Microsoft Excel 2016进行数据处理和图表绘制，采用Genstat 19软件进行单因素方差分析(ANOVA)和Duncan多重比较(P<0.05)。运用模糊数学(Fuzzy数学)中的隶属函数法将各项指标测定值进行标准化，按照公式：

X(μ)=(X-Xmin)/(Xmax-Xmin)

分别计算每个金属离子胁迫盐生草生长的发芽势、发芽率、鲜重、干重、株高、活力在不同浓度下的具体隶属函数值。式中X为该指标内某-测定值，Xmax和Xmin分别为该指标内的最大值和最小值[18]。采用SPSS25.0统计软件，以不同浓度Cu2+，Zn2+，Ni2+，Cd2+，Pb2+重金属离子胁迫盐生草萌发生长的各项标准化指标进行聚类分析与主成分分析。

2 结果与分析

2.1 重金属离子胁迫对盐生草种子萌发指标的影响

由表2可知，随着重金属Cu2+，Zn2+，Ni2+，Cd2+，Pb2+浓度的升高，盐生草种子的发芽势均呈先升高后降低的趋势，分别于0.30 mmol·L-1，0.10 mmol·L-1，0.10 mmol·L-1，0.05 mmol·L-1，0.10 mmol·L-1达到最大值，其中Cu2+处理中发芽势最大值与对照差异显著(P<0.05)，其他4种离子与对照差异均不显著，表明盐胁迫下低浓度的重金属离子对植物生长具有一定促进作用，但超过一定浓度后表现为抑制。Cu2+在0.30 mmol·L-1～1.00 mmol·L-1处理显著高于对照(P<0.05)，发芽势90%以上，具有明显促进作用，当其浓度为100.00 mmol·L-1时，发芽势较对照显著降低了18个百分点(P<0.05)；Zn2+和Pb2+的各处理浓度间发芽势均不显著；Ni2+在0.10 mmol·L-1处理较50.00 mmol·L-1处理显著降低了13.5%(P<0.05)，其他处理间差异均不显著；Cd2+在0.05 mmol·L-1，0.10 mmol·L-1显著高于4.00 mmol·L-1处理(P<0.05)，分别提高了25.42，16.06个百分点。重金属离子胁迫盐生草，随着各自浓度的升高，发芽率亦表现为先升高后下降的趋势，各处理分别于0.10 mmol·L-1，0.10 mmol·L-1，0.10 mmol·L-1，0.05 mmol·L-1，0.10 mmol·L-1达到最大值，但与对照之间差异不显著，Cu2+，Pb2+均显著高于最大浓度处理(P<0.05)，Cd2+显著高于1.50～4.00 mmol·L-1处理(P<0.05)，Zn2+和Ni2+各处理间差异均不显著。

2.2 重金属离子胁迫对盐生草幼苗鲜重和干重的影响

如图1所示，随着重金属浓度的增加，盐生草幼苗鲜重均呈现下降趋势，且各处理与对照差异显著(P<0.05)。Cu2+，Zn2+，Ni2+相同浓度处理下，鲜重进行比较：Zn2+>Ni2+>Cu2+。除Zn2+外的其余Cu2+，Ni2+，Cd2+，Pb2+的处理浓度分别在3.00～100.00 mmol·L-1，3.00～50.00 mmol·L-1，0.80～4.00 mmol·L-1，1.00～10.00 mmol·L-1时鲜重变化差异不显著，最后趋于稳定。除对照外，随着重金属浓度的增加，各重金属处理中盐生草幼苗干重均表现为持续降低的趋势，其中Cu2+，Cd2+，Pb2+处理随浓度增加逐渐趋于平稳，各处理的干重均低于对照且差异显著(P<0.05)，处理达到最大浓度时，与对照相比干重分别降低了30.1%，65.0%，30.1%；在Zn2+的0.10～10.00 mmol·L-1处理干重均高于对照，但差异不显著，浓度为50.00 mmol·L-1时的干重较对照降低了27.2%，差异显著(P<0.05)；Ni2+的0.10 mmol·L-1和0.30 mmol·L-1浓度处理的干重均高于对照，而0.5～50.00 mmol·L-1处理干重均低于对照，但各处理与对照比较差异均不显著。

表2 五种重金属处理对盐生草种子发芽势和发芽率的影响Table 2 Effects of five heavy metals treatments on germination energy and germination rate of Halogeton glomeratus seeds

注：表中数据为平均值±标准差；不同字母代表差异显著(P<0. 05)，下同；GI：发芽指标；GE：发芽势；GR：发芽率；C：浓度

Note:The data in the
Table are mean±standard deviation;Different letters indicate significant differences at the 0.05 level,the same as below;GI:Germination index;GE:Germination energy;GR:Germination rate;C:Concentration

图1 五种重金属处理对盐生草幼苗鲜重和干重的影响Fig.1 Effects of five heavy metals treatments on fresh weight and dry weight of Halogeton glomeratus seedlings

2.3 重金属离子胁迫对盐生草幼苗株高的影响

图2看出，株高的变化趋势与干重相接近，除对照外，随着重金属浓度的增加，各重金属处理中盐生草幼苗株高均表现为持续降低的趋势，其中Cu2+，Cd2+，Pb2+的各浓度处理的盐生草幼苗株高均低于对照，Cu2+各浓度处理均与对照差异显著(P<0.05)，且于3.00 mmol·L-1和10.00 mmol·L-1之间基本稳定，Cd2+和Pb2+分别在0.05～0.20 mmol·L-1，0.10～0.30 mmol·L-1之间与对照差异不显著，其他处理与对照差异均达显著水平(P<0.05)；Zn2+的0.10 mmol·L-1处理和Ni2+0.10 mmol·L-1及0.30 mmol·L-1处理高于对照。Cu2+，Zn2+，Ni2+，Cd2+，Pb2+胁迫盐生草幼苗高度降为对照50%以下的浓度分别为0.50 mmol·L-1，10.00 mmol·L-1，3.00 mmol·L-1，2.00 mmol·L-1，1.00 mmol·L-1。

图2 五种重金属处理对盐生草幼苗株高的影响Fig. 2 Effects of five heavy metals treatments on the seedling height of Halogeton glomeratus

2.4 重金属离子胁迫对盐生草幼苗离子含量的影响

图3可得，随着重金属浓度的增加，Cu2+，Zn2+，Ni2+的含量逐渐上升，其中Cu2+的胁迫浓度在3.00 mmol·L-1时离子含量增长迅速，较1.00 mmol·L-1增加了4.34倍，Zn2+胁迫浓度达到20.00 mmol·L-1时的离子含量是浓度10.00 mmol·L-1的3.29倍，Ni2+呈现阶梯式逐渐上升；Cd2+，Pb2+的含量呈现先上升后下降的趋势，分别于2.50mmol·L-1和5.00mmol·L-1时达到最大值。Cu2+，Zn2+，Ni2+，Cd2+，Pb2+在0.10～1.00 mmol·L-1，0.10～0.30 mmol·L-1，0.10～1.00 mmol·L-1，0.05～0.20 mmol·L-1，0.10～0.50 mmol·L-1浓度处理盐生草幼苗离子含量与对照差异均不显著。

图3 五种重金属处理对盐生草幼苗离子含量的影响Fig.3 Effects of five heavy metals treatments on the ion content of Halogeton glomeratus seedlings

2.5 重金属离子胁迫对盐生草幼苗根系活力的影响

将对照(CK)根系活力的OD值定为100%，其余各浓度指标与之相比可以看出(表3)，随着处理浓度的增加，Cu2+,Zn2+胁迫盐生草幼苗生长的根系活力呈先上升后下降趋势，Cu2+的处理浓度在0.10 mmol·L-1盐生草幼苗根系活力显著高于对照和0.30 mmol·L-1处理，后二者之间差异不显著，其他各处理均显著低于对照(P<0.05)，Zn2+浓度在0.10～5.00 mmol·L-1之间的幼苗根系活力虽略高于对照但差异不显著；Ni2+，Cd2+，Pb2+根系活力呈现下降的趋势，Ni2+，Pb2+各浓度处理的幼苗根系活力均显著低于对照(P<0.05)，Cd2+在0.05 mmol·L-1处理幼苗根系活力略低于对照但差异不显著，其他处理均显著低于对照(P<0.05)。Cu2+，Zn2+，Ni2+，Cd2+，Pb2+不足对照50%的浓度分别为3.00 mmol·L-1，30.00 mmol·L-1，1.00 mmol·L-1，2.50 mmol·L-1，10.00 mmol·L-1。

表3 五种重金属处理对盐生草幼苗根系活力的影响Table 3 Effects of five heavy metals treatments on the root activity of Halogeton glomeratus seedlings

注：RA：根系活力；C：浓度

Note:RA:Root activity;C:Concentration

2.6 综合聚类分析及主成分分析

由于测定的各项指标单位各不相同，首先运用模糊数学(Fuzzy数学)中的隶属函数法将各项指标测定值进行标准化[19]。然后采用组间联接—欧式距离法进行聚类分析。将Cu2+，Zn2+，Ni2+，Cd2+，Pb2+各处理浓度分别在欧式距离约为20，15，15，15，22处绘制跳变线，据此可将5种重金属的处理浓度分别划分为2个等级(图4)，得出Cu2+，Zn2+，Ni2+，Cd2+，Pb2+胁迫盐生草萌发生长的临界耐受浓度分别为：1.00 mmol·L-1，10.00 mmol·L-1，0.30 mmol·L-1，0.20 mmol·L-1，0.50 mmol·L-1。最后将各重金属离子临界耐受浓度的6个性状进行主成分分析，不同重金属离子的2个主成分的累积贡献率均达到了100%，第1主成分的贡献率大于第2主成分(表4)，结合各重金属离子的2个主成分与6个性状的相关系数(因子成分矩阵，表5)可以看出。Cu2+第1主成分的贡献率为80.716%，除干重指标外，其他指标均具有较大相关系数，其中发芽势，发芽率相关系数最大，达到了0.988，这2个性状可以归为萌发指标，第2主成分与干重有较高的正相关关系，但贡献率仅为19.284%；Zn2+的第1主成分的贡献率为75.980%，干重相关系数最大为0.998，第2主成分贡献率为24.020%；Ni2+第1主成分的特征值是3.344，贡献率为55.741%，0.971的发芽势相关系数最大，第2主成分的特征值为2.656；Cd2+的第1主成分的贡献率是64.697%，干重的相关系数最大且呈正向效应，为0.999，第2主成分的贡献率是35.303%；Pb2+第1主成分的特征值时3.696，贡献率为61.595%，发芽势相关系数最大是0.978，第2主成分的特征值为2.304，贡献率为38.405%。

图4 五种重金属处理不同浓度聚类树状图Fig. 4 Clustering dendrogram of five heavy metals treatments at different concentrations

表4 2个因子的特征值及贡献率Table 4 Eigen values of 2 principal components and their contribution and cumulative contribution

参数Parameter特征值Eigen value贡献率Contribution/%累计贡献率Cumulative contribution/%Cu2+PC14.84380.71680.716PC21.15719.284100.000Zn2+PC14.55975.98075.980PC21.44124.020100.000Ni2+PC13.34455.74155.741PC22.65644.259100.000Cd2+PC13.88264.69764.697PC22.11835.303100.000Pb2+PC13.69661.59561.595PC22.30438.405100.000

注：PC：主成分，下同

Note:PC:Principal component,the same as below

表5 各因子成分矩阵Table 5 Factor matrix of each component

3 讨论与结论

种子萌发是指种子吸水膨胀，胚重新恢复生长，胚根突破胚乳和种皮后完成萌发，是植株生长的第一个关键时期[20]。5种重金属离子胁迫盐生草的萌发，发芽势均呈现先升高后下降。尤其Cu2+在0.30～1.00 mmol·L-1处理发芽势均达到90%以上，具有明显促进作用。与相关研究重金属胁迫的结果相似，Deng等用重金属Cu2+，Cd2+，Pb2+胁迫玉米种子，浓度为0.10 mmol·L-1时，发芽率明显上升，1.00 mmol·L-1，10.00 mmol·L-1逐渐下降[21]，表明低浓度的重金属离子可促进植物的萌发。本试验中，随着处理浓度的增加，Zn2+，Ni2+，Cd2+，Pb2+各处理的发芽势与对照比较差异均不显著，说明这4种重金属离子对盐生草发芽势影响较小。5种重金属离子的发芽率均表现缓慢下降的趋势且与对照比较差异不显著。综上说明盐生草种子的萌发对Cu2+，Zn2+，Ni2+，Cd2+，Pb2+重金属离子具有较强耐性。

观察鲜重、干重、株高发现，随着5种重金属离子处理浓度的增加均呈现下降的趋势。李新博等研究的镉胁迫印度芥菜与苜蓿，能够显著降低它们的生物量(P<0.05)[22]。Bae等研究的重金属Cu2+，Zn2+，Ni2+，Cd2+，Pb2+胁迫禾本科杂草(A.artemisiifolia)和3种地被植物(Coronillavaria，Lotuscorniculatus和Trifoliumarvense)的地上和地下生物量积累量随着浓度的升高逐渐下降，4种植物的IC50(半抑制浓度)各不相同[23]。有研究表明，一定量的低浓度重金属对植物生长产生的促进作用，可能是由于刺激某些酶的活性，产生了某种自我保护作用，从而促进植物的生长。当重金属浓度含量增加到某一定值，这种自我保护反应就会消失，从而导致植物生长量下降[24]。本研究中，随着重金属浓度的增加，除对照外，各重金属处理中盐生草幼苗株高均表现为持续降低的趋势，除去Zn2+的0.10～0.30 mmol·L-1，Ni2+的0.30～0.50 mmol·L-1，Cd2+的0.05～0.20 mmol·L-1和Pb2+的0.10～0.30 mmol·L-1处理，其余浓度处理的株高与对照比较差异均显著(P<0.05)，说明高浓度的处理对盐生草幼苗生长有明显抑制作用。王宝媛等研究10 μmol·L-1Cd2+胁迫20个高羊茅品种的试验中，株高和根系长度均受到了显著抑制(P<0.05)[25]。

重金属胁迫7 d后，检测盐生草各处理幼苗对应的离子含量，得出Cu2+，Zn2+，Ni2+离子的含量随浓度的增加逐渐上升，说明随着处理浓度的增加，重金属在植物体内逐渐积累。汪军成研究NaCl胁迫盐生草，随处理浓度升高，检测盐生草根、茎、叶片中含盐量富集状态增多，呈现同样趋势现象[11]。Deng等研究Cu2+，Cd2+，Pb2+重金属离子胁迫玉米种子，处理浓度的升高可以显著提高这些重金属的积累水平(P<0.05)[21]。本试验Cd2+和Pb2+处理浓度分别到2.50 mmol·L-1和5.00 mmol·L-1时离子含量呈现下降趋势，可能由于较高浓度重金属胁迫已经使幼苗死亡，不再吸收重金属离子。测定盐生草胁迫7 d后的幼苗根系活力，得出Cu2+的5.00～100.00 mmol·L-1处理的活力与对照相比均达不到10%，严重影响盐生草后期成苗生长；Ni2+，Cd2+，Pb2+活力呈现缓慢阶梯式下降，处理浓度愈高根系活力愈低；Zn2+在0.10～5.00 mmol·L-1处理的幼苗根系活力与对照比较差异不显著，与其他重金属离子相比，盐生草生长对其胁迫更具有耐性。

主成分分析是将原来各项指标重新组合成一组新的彼此独立的几个综合指标，用少数的综合指标来反映原来多指标的信息[26]。孙东雷等运用此方法研究表明，在5 g·L-1NaCl盐胁迫下，相对含水量和相对鲜重这2个指标可作为评价花生品种耐盐性的主要鉴定指标[27]。于洁等发现，发芽率及幼苗干重可以快速鉴定苜蓿及扁蓿豆材料的耐盐性强弱[28]。本试验通过综合聚类分析得出：盐生草耐Cu2+，Zn2+，Ni2+，Cd2+，Pb2+的临界浓度分别为：1.00 mmol·L-1，10.00 mmol·L-1，0.30 mmol·L-1，0.20 mmol·L-1和0.50 mmol·L-1。以5种重金属离子临界浓度的各项测定指标进行主成分分析得出，Zn2+和Cd2+的干重指标贡献率较大，可能是由于Zn2+，Cd2+的胁迫对盐生草萌发生长过程中叶绿素的形成或酶活性等方面影响较大，进而影响幼苗生物量的积累[29]；Cu2+，Ni2+，Pb2+的发芽指标贡献率较大，可能是由于以上3种金属离子更多的抑制盐生草种子内储藏淀粉和蛋白质的分解，从而影响种子萌发所需的物质和能量，导致发芽指标对其更敏感[30]。

综上所述，在1.00 mmol·L-1Cu2+胁迫下的萌发指标可作为评价盐生草萌发期耐铜胁迫的主要鉴定指标；10.00 mmol·L-1Zn2+胁迫的主要鉴定指标为干重；0.30 mmol·L-1Ni2+胁迫的主要鉴定指标为发芽势；0.20 mmol·L-1Cd2+胁迫的主要鉴定指标为干重；0.50 mmol·L-1Pb2+胁迫的主要指标为发芽势。当盐渍化土壤受重金属Cu2+，Zn2+，Ni2+，Cd2+，Pb2+的污染，且浓度分别在1.00 mmol·L-1，10.00 mmol·L-1，0.30 mmol·L-1，0.20 mmol·L-1和0.50 mmol·L-1以下时，盐生草均正常萌发生长。因此，可以确定，当重金属Cu2+，Zn2+，Ni2+，Cd2+或Pb2+含量不超过以上数值时，盐生草可以用于植物修复重金属污染盐渍化土壤。