氮沉降对贝加尔针茅草原土壤真菌群落结构的影响

2019-04-16刘红梅张海芳杨殿林

草地学报 2019年1期

刘红梅, 张海芳, 秦洁, 杨殿林

(农业农村部环境保护科研监测所，农业农村部产地环境污染防控重点实验室/天津市农业环境与农产品安全重点实验室，天津 30019)

自工业革命以来，由于工农业生产、化肥的使用及畜牧业的发展等向大气中排放的含氮化合物剧增，大气氮沉降成比例增加，带来一系列的生态环境问题，如土壤酸化[1]、营养失衡、植物多样性降低[2]等，影响了陆地生态系统的结构和功能。氮沉降对陆地生态环境的影响已成为国内外生态和环境研究的热点问题之一。

土壤微生物是土壤生态系统变化的敏感指标，用来指示土壤质量变化。氮素是大多数陆地生态系统的重要限制因素[3]，氮沉降增加可以通过影响土壤化学性质变化[4]，引起土壤微生物活性[5]、土壤微生物群落结构改变，也可以通过影响地上植物的生长间接影响土壤微生物群落结构[6]。真菌作为土壤微生物中的重要组成部分，在土壤生态中具有不可忽视的地位[7]，与土传病害、植物互作、分解有机物质等密不可分[8-9]，因此研究氮沉降对土壤真菌的影响具有重要意义。之前研究表明施入氮肥会降低真菌的生物量，降低多样性和改变真菌的组成结构[10]，增加病原菌丰度[11]；长期施氮导致东北黑土由健康易于保持平衡的“细菌型”向易发生土传病害的“真菌型”转变[12]。

贝加尔针茅草原是我国北方温带草原，氮素是该系统生长发育的限制因子。有研究表明，该温带草原每年氮沉降量高达3.43 g·m-2，并且在未来仍将持续增加[13]。本文通过模拟氮沉降增加，应用Illumina Miseq高通量测序技术，研究不同氮沉降水平下贝加尔针茅草原土壤真菌群落结构的变化特征，及其与土壤理化性质的偶联关系，为深入研究氮沉降增加对草原土壤生态系统影响提供参考。

在我国有很多校企合作培养应用型人才的模式，即学生在学校学习专业知识，在暑期或者大三以后到企业进行实践联系，将自己在学校学习到的专业知识应用到工作中，这样学习-生产-实践的模式能够使学生熟练的掌握专业知识，积累工作经验，为以后的工作打下坚实的基础。总之，高校在进行小语种人才培养时，应该注重与企业的合作，不断提高学生的综合素质。

1 材料与方法

1.1 试验地概况

试验区域概况、试验地主要植物、试验开始前土壤理化性质及试验设计详见参考文献[5]。试验样地在内蒙古贝加尔针茅草原的典型地带(119°41′ E，48°35′ N)。海拔平均高度为760 m，半干旱大陆性季风气候，年降水量328.7 mm，年均气温-1.6 ℃，土壤类型为暗栗钙土。植被类型主要为贝加尔针茅(Stipabaicalensis)和羊草(Leymuschinensis)。选择植被典型、地势平坦地段设置模拟氮沉降试验，四周用围栏保护。于2010年6月开始模拟氮沉降试验，氮处理设8个水平，对照N0，低氮沉降(15，30，50 kg N·hm-2·a-1)分别记为N15，N30和N50，高氮沉降(100，150，200，300 kg N·hm-2·a-1)分别记为N100，N150，N200和N300。氮添加于每年6月中旬和7月中旬分两次施入，氮肥为NH4NO3。4次重复，小区面积8 m×8 m，小区间设2 m隔离带，重复间设5 m隔离带。

不同氮沉降处理下土壤真菌属水平组成分析(表3)。0～10 cm土层，8个处理之间优势菌属Archaeorhizomyces的相对丰度存在显著性差异，N15，N30处理显著高于对照(P<0.05)，而N50、N100、N150，N200和N300则低于或显著低于对照；N15，N30，N50处理Fusarium相对丰度与对照无显著差异，N100、N150、N200和N300处理则显著高于对照(P<0.05)；N50和N100处理Arnium相对丰度显著高于对照(P<0.05)，N15、N30与对照相比无显著差异，N150，N200，N300显著低于对照(P<0.05)；N50，N100，N150，N200处理的Paramicrothyrium相对丰度显著高于对照(P<0.05)，N15，N30，N300处理与对照无显著差异。10～20 cm土层，除N50处理外，其他氮沉降处理Archaeorhizomyces的相对丰度均显著低于对照(P<0.05)；N15，N30，N50和N200处理的Fusarium相对丰度与对照无显著差异，N100和N300处理则显著高于对照(P<0.05)；N15，N30，N50，N100和N150处理Arnium相对丰度高于或显著高于对照，N200和N300处理则低于或显著低于对照；氮沉降提高了10～20 cm土层Paramicrothyrium相对丰度。氮沉降处理显著降低了两个土层Entoloma属相对丰度。同一氮沉降处理，不同土层5种优势菌属总体上差异明显，表明5种优势菌属在两个土层中存在着土层梯度效应。

1.2 样品采集

CCA分析主要反映样品、菌群与环境因子之间关系。分别对不同氮沉降处理不同土层优势真菌门与土壤化学因子进行CCA分析。0～10 cm土层真菌群落结构CCA分析结果显示(图2，A)，前两轴可解释群落结构变化的86.3%。土壤pH(P=0.002)、硝态氮含量(P=0.002)、有机碳(P=0.006)、速效磷含量(P=0.004)和全磷含量(P=0.01)与土壤真菌群落组成显著相关。10～20 cm土层真菌群落结构CCA分析结果显示(图2，B)，前两轴可解释群落结构变化的93.0%。土壤pH(P=0.002)、有机碳(P=0.006)、硝态氮含量(P=0.008)、铵态氮含量(P=0.002)和速效磷含量(P=0.038)与土壤真菌群落组成显著相关。综合分析认为，影响土壤真菌群落结构主要因素是pH、硝态氮、有机碳和速效磷。

1.3 测定方法

Sordariomycetes相对丰度在两个土层中，均以N50处理最高，显著高于其他氮沉降处理。氮沉降提高了10～20 cm土层Dothideomycetes相对丰度，显著降低了两个土层Agariomycetes相对丰度。高氮沉降(N100、N150、N200和N300)处理显著降低了两个土层Archaeorhizomycetes相对丰度。高氮沉降(N150、N200、N300)处理显著降低了两个土层Eurotiomycetes相对丰度。高氮沉降(N100、N150、N200、N300)处理提高了0～10 cm土层Incertae相对丰度，降低了10～20 cm土层Incertae相对丰度。同一氮沉降处理，不同土层6种优势菌纲总体上差异明显，表明6种优势菌纲在两个土层中存在着土层梯度效应。

土壤DNA提取和ITS区高通量测序：使用美国MOBIO公司的PowerSoil®DNA Isolationkit试剂盒提取土壤总DNA，依据试剂盒说明书方法提取。提取后的土壤总DNA用1%琼脂糖凝胶电泳进行检测，使用NanoDrop(2000)超微量分光光度计进行质检。为了使土壤总DNA具有重复性和代表性，每个处理的每个重复样品，提取3次DNA，分别进行扩增，混合均匀后送至北京奥维森基因科技有限公司，应用Illumina MiSeq平台进行测序。扩增引物为ITS1F/ITS2 (ITS1F:5′-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3′,ITS2:5′-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3′)。Illumina Miseq平台测序的主要步骤：按指定测序区域，合成带有barcode的特异引物，使用Qubit荧光定量系统对PCR产物进行定量检测。依据每个样本的测序量要求以及定量结果进行相应比例的混合。然后将含有标签的接头与DNA片段链接。选择性地富集两端连有接头的DNA片段，扩增DNA文库，使用测序平台对真菌ITS区进行测序。

1.4 数据统计与分析

另外，阳泉市大部分地表水污染相当严重，如桃河、温河水，水质类别为Ⅴ类，乃至劣Ⅴ类水，加之河流底泥污染严重，污染的河水通过以上废弃污染井的入渗污染下部地下水。

2 结果与分析

2.1 土壤化学性质变化

选取两个土层相对丰度均大于1%的6个纲进行方差分析(表2)。0～10 cm土层，粪壳菌纲Sordariomycetes(相对丰度10.27%～20.02%)，伞菌纲Agariomycetes(相对丰度5.56%～15.78%)，谷菌根菌纲Archaeorhizomycetes(相对丰度3.13%～11.44%)，散囊菌纲Eurotiomycetes(相对丰度2.52%～5.29%)，座囊菌纲Dothideomycetes(相对丰度1.44%～4.46%)，丝足虫纲Incertae(相对丰度1.07%～2.33%)。10～20 cm土层，粪壳菌纲Sordariomycetes(相对丰度13.95%～22.64%)，座囊菌纲Dothideomycetes(相对丰度8.44%～13.73%)，伞菌纲Agariomycetes(相对丰度4.15%～9.01%)，散囊菌纲Eurotiomycetes(相对丰度1.84%～4.25%)，谷菌根菌纲Archaeorhizomycetes(相对丰度0.68%～3.60%)，丝足虫纲Incertae(相对丰度0.89%～1.53%)。

2.2 土壤真菌优势门的相对丰度变化

不同氮沉降处理的土壤中检测到7个真菌门，优势真菌有5个。0～10 cm土层，子囊菌门Ascomycota (相对丰度26.80%～39.98%)，担子菌门Basidiomycota(5.57%～15.84%)，接合菌门Zygomycota (1.47%～3.01%)，球囊菌门Glomeromycota (0.10%～3.47%)，壶菌门Chytridiomycota (0.05%～0.73%)(见图1)。随着氮沉降水平的提高，子囊菌门相对丰度呈先升高后降低的趋势，在N50处理时最高。氮沉降处理的Basidiomycota与Glomeromycota均显著低于对照N0(P<0.05)。N15的Zygomycota略低于对照N0，但无显著差异，其他氮沉降处理的Zygomycota均显著高于对照N0(P<0.05)。N150、N200和N300的Chytridiomycota显著高于对照N0(P<0.05)，而N15、N30、N50、N100的低于或显著低于对照N0。10～20 cm土层，子囊菌门Ascomycota (相对丰度35.80%～55.14%)，担子菌门Basidiomycota(4.31%～9.17%)，接合菌门Zygomycota (1.19%～1.91%)，球囊菌门Glomeromycota (0.29%～1.19%)，壶菌门Chytridiomycota (0.03%～0.09%)(图1)。N0处理Ascomycota的相对丰度为42.99%，N30处理、N50和N200处理分别提高到44.51%、55.14%和46.28%，N50处理最高，而N15、N100、N150和N300处理均显著低于对照N0(P<0.05)。氮沉降处理的Basidiomycota均显著低于对照N0(P<0.05)。N200、N300的Zygomycota低于对照N0，但无显著差异，其他氮沉降处理的Zygomycota均显著低于对照N0(P<0.05)。N100、N300的Glomeromycota与对照无显著差异，N15、N30、N50、N150、N200的Glomeromycota显著高于对照N0(P<0.05)。N150、N200和N300的Chytridiomycota高于或显著高于对照N0，而N15、N30、N50、N100的低于或显著低于对照N0。可见连续6年氮沉降引起了两个土层真菌优势菌门相对丰度的差异，且表现出了土层之间的差异。

表1 不同氮沉降水平下土壤化学性质的变化Table 1 Soil chemical properties in different nitrogen deposition treatments

注：同列不同字母表示处理之间差异显著(P<0.05)

Note:Different letters within the same column indicate significant difference among treatments at the 0.05 level

图1 不同氮沉降处理土壤真菌门类相对丰度变化Fig.1 Relative abundances of the dominant fungal phylum under different nitrogen deposition treatments

连续6年不同氮沉降水平下，土壤化学性质变化见表1。0～10 cm土层，7种氮沉降处理土壤pH值均低于对照N0。10～20 cm土层，高氮沉降处理(N100，N150，N200和N300)pH值显著低于对照N0(P<0.05)，低氮沉降处理(N15，N30和N50)pH值与对照无显著差异。0～10 cm土层与10～20 cm土层，高氮沉降处理(N100，N150，N200和N300)有机碳、硝态氮、铵态氮和速效磷含量均高于或显著高于对照N0。

土壤化学性质测定：土壤总有机碳测定采用重铬酸钾外加热法，土壤全氮用凯氏定氮法，土壤全磷采用钼锑抗比色法，土壤pH采用玻璃电极法(土水质量比1:2.5)，土壤铵态氮和硝态氮含量采用氯化钾溶液提取-流动分析仪(QC8000)测定，土壤速效磷采用碳酸氢钠提取-钼锑抗比色法[14]。

通过Illumina MiSeq平台进行Paired-end测序，使用Trimmomatic软件修剪数据末端碱基，以Q20≥90的标准用Readfq(vertion 6.0)软件将低质量的成对reads过滤掉；利用FLASH (version 1.2.10)软件把成对的reads通过其overlap拼接到一条序列，拼接的错误匹配率为0.1。利用Mothur软件去除长度小于200bp的序列和maxhomop大于10的序列，并去除嵌合体。在0.97相似度下利用QIIME(v1.8.0)软件将拼接过滤后的序列聚类为用于物种分类的OTU(Operational Taxonomic Units)，统计各个样品每个OTU中的丰度信息，OTU的丰度初步说明了样品的物种丰富程度。为了得到每个OTU对应的物种分类信息，对OTU代表序列进行分类学分析，并在各个水平统计每个样品的群落组成。采用SPSS16.0软件进行单因素ANOVA分析，并用Turkey显著差异法分析处理间的差异显著性。采用CANOCO5.0将土壤化学性质和真菌群落组成进行典范对应分析(CCA)。

总之，目前学界对于马克思共产主义思想的理解更多地生成于对于文本的解读和其时代精神的诠释，思想理论的祛魅化阐释成效显著，已有成果较为全面地展现出马克思这一思想的本真性内涵和精神本质，为人们深入研究马克思哲学超越维度奠定了坚实的理论基础。

2.3 土壤真菌优势属的相对丰度变化

以上这些对人的能力、潜力的平等主义、乐观主义的思想，是增能理论的核心的理论基础，增能理论就是把每个人的内在力量、内在资源作为自己的核心理论基石。

表2 不同氮沉降处理的土壤真菌纲相对丰度Table 2 Relative abundances of fungal common class under different nitrogen treatments/%

注：表中列出的真菌均为8个处理中至少有一个处理的相对丰度> 1%；同行不同小写字母表示处理间差异显著，同列不同大写字母表示同一氮沉降水平土层之间差异显著。下同

Note：The relative abundance of the fungi listed in the
Table is higher than 1% at one of the eight treatments at least；Different small letters within the same line indicate significant difference among treatments at the 0.05 level,different capital letters within the same column indicate significant difference between the horizontal soil layers of the same nitrogen treatment at the 0.05 level. The same as below

表3 不同氮沉降处理的土壤真菌属相对丰度Table 3 Relative abundances of fungal common genera under different nitrogen treatments/%

2.4 典范对应(CCA)分析

于2015年8月中旬，在各个不同处理小区内按照S型取样法选取10个点，去除表面植被，取0～10 cm，10～20 cm土层土壤各自分别混匀。去除根系和土壤入侵物，将其分成两份，一份迅速装入无菌封口袋，放在冰盒中带回实验室，放入-20℃低温保存，用于测定土壤微生物群落分析，另一份土样室内自然风干用于土壤理化性质测定(用鲜土测定土壤铵态氮、硝态氮和速效磷含量)。

图2 优势真菌门(A,0～10 cm土层；B,10～20 cm土层)与土壤化学因子CCA分析Fig.2 Canonical correspondence analysis (CCA) on soil dominant fungal phyla and soil chemical properties (A,0～10 cm soil layer;B,10～20 cm soil layer)注：○N0，×N15，△N30，▽N50，□N100，+N150，◇N200，☆N300Note:○N0,×N15,△N30,▽N50,□N100,+N150,◇N200,☆N300

3 讨论

大量研究表明，氮肥降低真菌生物量[15]，降低真菌多样性，改变土壤中真菌的组成结构[10,16]。本研究通过门、纲和属三个水平的相对丰度分析可知，不同氮沉降水平明显改变了贝加尔针茅草原土壤真菌群落结构和丰度，且在0～10 cm土层和10～20 cm土层土壤中表现出不同的响应模式。已有研究结果表明，土壤真菌组成与土壤剖面层次、施肥量有关[17]。Chen等[6]研究认为，Ascomycota是中国北方干旱和半干旱草原主要优势真菌。本研究中，Ascomycota是贝加尔针茅草原土壤的优势类群。这与其研究一致。klaubauf等[18]研究表明，氮肥能够促进优势真菌类群的生长。Wang等[19]研究表明，氮素过高对Ascomycota类的真菌生长有害。Edwards等[20]研究表明，氮沉降提高会显著降低Ascomycota相对丰度。本研究中，0～10 cm土层，高氮沉降处理(N100、N150、N200和N300)Ascomycota显著低于对照N0，表明这类真菌对高氮环境较为敏感。Ascomycota类真菌的丰度的降低反过来会影响土壤中碳的降解。本研究中，氮沉降处理均显著降低了两个土层的担子菌门Basidiomycota的相对丰度，尤其是Agariomycetes纲的相对丰度。这是因为Agariomycetes多数属于丛枝菌根且多为腐生菌，能分泌过氧化物酶从而促进土壤中木质素、作物残留物的分解[21]。刘星等[22]研究发现，氮沉降降低了土壤过氧化物酶活性。推测是由于连续氮沉降降低了Agariomycetes对养分和能源的竞争力，导致其生长缓慢。Dothideomycetes纲对细胞壁的降解有重要贡献[23]，对于植物的降解和全球碳循环有重要作用，本研究中10～20 cm土层中所有氮沉降处理中该类真菌都升高，这表明氮沉降提高了10～20 cm土层土壤微生物对土壤中凋落物分解的贡献。Fusarium属是反硝化功能的重要菌属，其功能是进行反硝化，从而减少土壤中氮素含量。本研究中，氮沉降提高了0～10 cm土层Fusarium属的相对丰度，虽然Fusarium物种丰度的增加并不一定意味着反硝化速率的增加，但也是一个重要影响因素。Ochoa-Hueso等研究发现，氮沉降改变了土壤碳氮的存储能力、净氮矿化能力[24]。

本研究通过土壤化学性质与真菌组成的CCA分析，可以知道土壤化学性质影响着贝加尔针茅草原土壤真菌群落结构。土壤pH为陆地生态系统中土壤真菌群落变化的关键因子[25]，这可能与土壤养分物质存在的形式有关系。土壤真菌以土壤有机质为养分和能源，因此，土壤有机碳的变化，对土壤真菌的影响较大。Liu等(2015)研究证明，土壤有机碳含量决定了东北地区真菌群落的地理分布[26]。本研究中，高氮沉降显著增加了土壤有机碳含量[5]，其原因可能是氮沉降促进了地上植被的生长，生物量增加[27]，从而使得进入土壤的植物残体和根系分泌物增加。典范对应分析也表明，土壤pH值、土壤有机碳、硝态氮含量与土壤真菌群落结构显著相关，表明土壤真菌群落参与了土壤碳氮循环。进一步研究可通过同位素示踪等方法，明确真菌在贝加尔针茅草原土壤有机质分解与氮素转化中的过程和作用机制，对贝加尔针茅草原生态系统健康及可持续发展至关重要。