胡长玉 戴 毅 王雅群 卢玮玮 王卫东 吴永祥,2

(1. 黄山学院生命与环境科学学院，安徽 黄山 245041；2. 安东国立大学食品科学与生物技术学院，韩国 安东 760749；3. 黄山峰源生物科技有限公司，安徽 黄山 245600)

祁白术是特产于中国安徽祁门山区野生白术(AtractylodesmacrocephalaKoidz.)的干燥根茎，在安徽民间一直被视为珍贵补品，为安徽著名道地药材[1]。郑丽[2]对白术的种质资源遗传多样性进行了深入研究，表明祁白术拥有丰富的遗传多样性，在cpDNA和核基因水平上，都展现出特殊的群体结构。李云志等[3-4]对祁白术的化学成分进行了分离鉴定，揭示了野生祁白术与栽培白术具有不同的药效物质基础。祁白术含有挥发油、内酯类物质、多糖、多酚等生物活性物质[5-7]，具有抗氧化、抑菌、降血糖和降血脂等功效[8-9]。祁白术道地性及优良品质的形成与当地生态大环境、群落微环境及遗传因子密切关系[10-11]。本课题组前期[8]研究了祁白术不同极性萃取物的多酚、黄酮含量及抗氧化、抑菌活性，采用GC-MS分析了其主要化学成分，表明多酚是祁白术的主要活性成分，是其发挥抗氧化、抑菌作用的药效物质基础。

目前国内外学者[12-13]对白术化学成分及功效的研究都是基于栽培白术，祁白术多酚提取工艺优化的研究尚未见报道，对祁白术多酚的抗氧化、抑菌作用的研究仍然缺乏。本试验拟以祁白术为原料，采用表面活性剂SDS协同超声波提取祁白术多酚，在单因素试验的基础上，采用响应面优选提取工艺条件，同时研究祁白术多酚的抗氧化、抑菌活性，旨在为祁白术多酚的综合开发应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 材料与试剂

祁白术：采自安徽省祁门县古溪乡，采样时间为2017年8月，由黄山学院植物学专家方建新老师鉴定为野生祁白术(AtractylodesmacrocephalaKoidz.)的干燥根茎；

金黄色葡萄球菌 (Staphylococcusaureus)、枯草芽孢杆菌 (Bacillussubtilis)、大肠杆菌 (Escherichiacoli)、绿脓杆菌 (Pseudomonasaeruginosa)：中国典型培养物菌种保藏中心(CCTCC)；

Folin-Ciocalteu试剂、丁基羟基茴香醚 (butyl hydroxy anisd, BHA)、丹宁酸、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)、对羟基苯甲酸丙酯(propylparaben，PP)、2,2-联氮-二 (3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸) 二铵盐(ABTS)、十二烷基硫酸钠(sodium dodecyl sulfonate, SDS)：分析纯，美国Sigma-Aldrich公司；

营养琼脂培养基：生物试剂，北京奥博星生物技术有限责任公司。

1.1.2 主要仪器设备

全波长酶标仪：SpectraMax-190型，美国Molecular Devices公司；

超净工作台：ZHJH-C2109B型，上海智城分析仪器制造有限公司；

转蒸发仪：EV341型，北京莱伯泰科仪器有限公司；

数控加热功率可调型超声波清洗器：SCQ-5201C型，上海声彦超声波仪器有限公司；

高压灭菌器：SQ510C型，重庆雅马拓科技有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 祁白术多酚的提取 将新鲜祁白术洗净晾干，于60 ℃ 烘干至恒重，粉碎成粉末，过80目筛。取祁白术粉末3.0 g，按照设计安排选取相应的SDS质量分数、超声功率、超声温度、超声时间、乙醇浓度、料液比进行提取。抽滤后经旋转蒸发浓缩，得到祁白术多酚提取物。

1.2.2 多酚含量测定 采用Folin-Ciocalteu法[14]。以吸光值Y为纵坐标，以标准品单宁酸(tannic acid, TA)浓度为横坐标，绘制标准曲线Y=0.001 4X+0.005 3(R2=0.996)。根据上述标准曲线计算不同提取条件下祁白术多酚含量，结果以每克祁白术提取物中含有相当单宁酸毫克数表示，即 mg TA/g。

1.2.3 单因素试验

(1) SDS质量分数：固定超声功率180 W，超声温度60 ℃，超声时间10 min，乙醇浓度60%，料液比1∶20 (g/mL)，考查SDS质量分数(0.0%，0.2%，0.4%，0.6%，0.8%，1.0%)对多酚提取量的影响。

(2) 超声功率：固定SDS质量分数0.6%，超声温度60 ℃，超声时间10 min，乙醇浓度60%，料液比1∶20 (g/mL)，考查超声功率(120，150，180，210，240 W)对多酚提取量的影响。

(3) 超声温度：固定SDS质量分数0.6%，超声功率180 W，超声时间10 min，乙醇浓度60%，料液比1∶20 (g/mL)，考查超声温度(40，50，60，70，80 ℃)对多酚提取量的影响。

(4) 超声时间：固定SDS质量分数0.6%，超声功率180 W，超声温度60 ℃，乙醇浓度60%，料液比1∶20 (g/mL)，考查超声时间(5，10，15，20，25 min)对多酚提取量的影响。

(5) 乙醇浓度：固定SDS质量分数0.6%，超声功率180 W，超声温度60 ℃，超声时间10 min，料液比1∶20 (g/mL)，考查乙醇浓度(40%，50%，60%，70%，80%)对多酚提取量的影响。

(6) 料液比：固定SDS质量分数0.6%，超声功率180 W，超声温度60 ℃，超声时间10 min，乙醇浓度60%，考查料液比[1∶10，1∶15，1∶20，1∶25，1∶30 (g/mL)]对多酚提取量的影响。

1.2.4 响应面试验设计 采用Box-Behnken设计原理，根据单因素试验的结果设计响应面试验，以祁白术多酚提取量为响应值，以SDS质量分数、超声功率、超声温度和乙醇浓度为试验因子，建立响应面优化方案，进行二次多项回归方程拟合及其优化分析。

1.2.5 抗氧化活性的测定

(1) DPPH自由基清除能力：参考文献[15]，以BHA为阳性对照。

(2) ABTS自由基清除能力：参考文献[16]，以BHA为阳性对照。

1.2.6 抑菌活性的测定

(1) 菌种活化与菌悬液制备：将4种供试菌接种到试管营养琼脂培养基斜面进行活化，活化传代2次后，在无菌操作台内各挑取已活化好的菌种置于无菌生理盐水中，配置各菌悬液浓度约为106～107CFU/mL。

(2) 祁白术多酚的抑菌活性：根据文献[17]修改如下：吸取100 μL供试菌悬液均匀涂布各平板上，用移液枪于无菌直径6 mm的滤纸片中央加入10 μL祁白术多酚提取物，以对羟基苯甲酸丙酯 (PP) 为阳性对照，以二甲基亚砜(DMSO)为空白对照组，37 ℃倒置培养24 h后测量抑菌圈直径，结果重复3次，取平均值。

(3) 最小抑菌浓度的测定：用DMSO溶剂溶解祁白术多酚，配制成0.25，0.50，0.75，1.00 mg/mL的样品溶液，然后参照文献[18]的方法，观察各平板抑菌圈的有无，首次出现抑菌圈所对应的浓度即为祁白术多酚的MIC。

1.3 统计学分析

采用SigmaPlot 10.0软件处理单因素数据和作图。采用Design-Expert 8.0.6软件进行响应面分析。采用SPSS 18.0统计分析软件，利用单因素方差分析(One-way ANOVA)中的Duncan’s多重比较法进行差异比较(P<0.05)。

2 结果与分析

2.1 祁白术多酚提取的单因素试验

2.1.1 SDS质量分数对祁白术多酚提取量的影响 如图1 所示，祁白术多酚提取量随着SDS质量分数的增加呈先增加后下降趋势。与未添加SDS组 [ (20.90±0.95) mg/g ]相比，当SDS添加量为0.4%时祁白术多酚提取量达到最大值，为(27.55±0.82)mg/g，多酚提取率提高了31.34%，存在着显著性差异(P<0.05)。表明表面活性剂SDS的添加，增加了溶液中胶束数量，从而增强了溶解作用，有利于多酚类物质的溶出，但当SDS添加量达到临界胶束浓度后，形成的胶束数量不再增加，多酚提取量亦不再增加[19-20]。因此，选取SDS质量分数为0.2%～0.6%作为响应面考察条件。

不同字母表示差异显著 (P<0.05)图1 SDS质量分数对多酚提取量的影响Figure 1 Effect of SDS concentration on the extraction efficiency of polyphenols

2.1.2 超声功率对祁白术多酚提取量的影响 如图2所示，祁白术多酚提取量随着超声波功率的增加呈先增加后下降趋势。当超声功率为150 W时，多酚提取量达到最大值，为(28.80±1.04) mg/g。表明超声波可以破坏植物细胞壁，增加细胞膜通透性，利于胞内多酚物质的溶出，但功率过大可能会导致某些多酚物质结构被破坏，从而提取量下降[21]。因此，选取超声功率120～180 W作为响应面考察条件。

不同字母表示差异显著 (P<0.05)图2 超声功率对多酚提取量的影响Figure 2 Effect of ultrasonic power on the extraction efficiency of polyphenols

2.1.3 超声温度对祁白术多酚提取量的影响 如图3所示，随着温度的升高，祁白术多酚提取量增大，在温度50 ℃ 时，多酚的提取量达到最大，为(30.75±1.39) mg/g。当超声温度继续升高，祁白术多酚提取量转而下降。这与多酚类物质的热稳定性有关，以及当温度接近乙醇沸点时，溶剂挥发加快，浸出过程难以稳定，从而造成提取量降低[22]。因此，选取超声温度40～60 ℃作为响应面考察条件。

2.1.4 超声时间对祁白术多酚提取量的影响 如图4所示，在5～15 min时，祁白术多酚提取量随着超声时间的延长逐步提高。当超声时间为15 min时，多酚提取量达到最大值，为(28.14±0.79) mg/g。随着超声时间继续延长，祁白术多酚由于长时间受热及超声波处理导致多酚类物质被氧化而被破坏是其提取量下降的主要原因。因此，选取15 min作为后续试验的最佳提取时间。

不同字母表示差异显著 (P<0.05)图3 超声温度对多酚提取量的影响

Figure 3 Effect of ultrasonic temperature extraction time on the extraction efficiency of polyphenols

不同字母表示差异显著 (P<0.05)图4 超声时间对多酚提取量的影响Figure 4 Effect of ultrasonic extraction time on the extraction efficiency of polyphenols

2.1.5 乙醇浓度对祁白术多酚提取量的影响 如图5所示，乙醇浓度为40%～80%时，祁白术多酚提取量随着乙醇浓度的增加先增加后下降，在60%时多酚提取量达到最大值，为(29.44±0.93) mg/g。增大乙醇浓度可以降低溶剂体系的极性，使得溶剂更容易破坏祁白术多酚类物质与多糖、蛋白质等物质的氢键，利于胞内多酚物质的溶出，但当乙醇浓度较高时，脂溶性物质、糖类及黏性物质等大量渗出，影响多酚类物质的提取，同时破坏多酚的稳定性，导致多酚提取量下降。因此，选取乙醇浓度50%～70%作为响应面考察条件。

2.1.6 料液比对祁白术多酚提取量的影响 如图6所示，料液比在1∶10～1∶25 (g/mL)时，祁白术多酚提取量随着溶剂添加量的增加而增加，当料液比在1∶25～1∶30 (g/mL)时，多酚提取量变化不明显。可能是料液比在1∶25 (g/mL)时，溶剂对祁白术多酚类物质溶解已达到平衡，增加溶剂量对增加多酚的提取量几乎无影响。因此，选取料液比为1∶25 (g/mL)作为后续试验。

不同字母表示差异显著 (P<0.05)图5 乙醇浓度对多酚提取量的影响Figure 5 Effect of ethanol concentration on the extraction efficiency of polyphenols

不同字母表示差异显著 (P<0.05)图6 料液比对多酚提取量的影响Figure 6 Effect of solid-liquid ration on the extraction efficiency of polyphenols

2.2 响应面优化试验结果与分析

2.2.1 回归模型的建立 因素水平及编码见表1。固定超声时间为15 min，料液比为1∶25 (g/mL)，以SDS质量分数、超声功率、超声温度和乙醇浓度为试验因子，祁白术多酚提取量为响应值，设计四因素三水平Box-Behnken试验，试验结果见表2。表2的数据用Design-Expert V8.0.6分析可得回归方程：

Y=36.94+2.13A+1.07B-1.31C+1.14D+0.68AB-0.27AC+0.21AD+0.14BC+0.24BD-0.36CD-3.50A2-3.43B2-3.99C2-1.51D2。

(1)

表1 Box-Behnken试验设计Table 1 Experimental design of Box-Behnken

表2 响应面试验结果Table 2 The results of response surface methodology

从表3还可以得到各因素对祁白术多酚提取量影响的顺序为SDS质量分数(A)>超声温度(C)>乙醇浓度(D)>超声功率(B)，其中A和B因素对祁白术多酚提取量的影响极显著，各因素交互作用影响不显著(P>0.05)，A2、B2、C2对多酚提取量影响极显著(P<0.000 1)，D2对多酚提取量影响显著(P<0.05)。剔除不显著交互项，得到祁白术多酚提取量对各自变量的标准回归方程为：

Y=36.94+2.13A+1.07B-1.31C+1.14D-3.50A2-3.43B2-3.99C2-1.51D2。

(2)

表3 回归模型方差分析†Table 3 Analysis of variance (ANOVA) regression model

† * 表示差异显著(P<0.05)；**表示差异极显著(P< 0.01)。

将表3中数据进行响应面曲线分析，二者呈较好的二次抛物线关系，祁白术多酚提取量存在最大值。

2.2.3 最佳工艺提取条件的确定及验证实验 根据二次线性回归方程的分析结果，祁白术多酚提取的最优条件为：SDS添加量0.47%、超声功率156.02 W、超声温度48.08 ℃、乙醇浓度64.39%，多酚提取量为37.79 mg/g。在实际生产中，考虑到可操作性，确定祁白术多酚的提取的最优工艺为：SDS添加量0.47%，超声波功率150 W，超声温度48 ℃，乙醇浓度64%。采用上述条件，进行验证实验(n=3)，祁白术多酚提取量为(38.53±0.51) mg/g，与理论预测值37.79 mg/g 的相对误差为1.92%，说明回归模型与实际情况拟合良好。

2.3 祁白术多酚的抗氧化活性

2.3.1 对DPPH自由基的清除作用 由图7可知，祁白术多酚对DPPH自由基的清除作用呈明显的剂量效应，即随着多酚浓度的增加，DPPH自由基清除作用随之增强。当祁白术多酚浓度为0.2 mg/mL时，对DPPH自由基的清除率为94.37%。祁白术多酚和阳性对照BHA对DPPH自由基清除作用的IC50值分别为0.056，0.015 mg/mL，表明祁白术多酚具有显著的DPPH自由基清除能力。

图7 祁白术多酚对DPPH自由基的清除作用Figure 7 DPPH free radical scavenging ability of QBP

2.3.2 对ABTS自由基的清除作用 由图8可知，在0.01～0.20 mg/mL时，祁白术多酚和BHA对ABTS自由基清除作用随着浓度的增大先逐渐增强后趋向稳定。当QBP浓度为0.2 mg/mL时，对ABTS自由基的清除率为88.39%。祁白术多酚和阳性对照BHA对ABTS自由基的清除作用的IC50值分别为0.05，0.02 mg/mL。以上结果显示，祁白术多酚对DPPH和ABTS自由基清除作用的变化规律具有较好的一致性，说明多酚类物质是祁白术主要的抗氧化活性成分。

2.4 祁白术多酚的抑菌活性

由表4可知，祁白术多酚对4种供试菌均有显著的抑制作用。当祁白术多酚质量浓度为1 mg/mL时，对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌和绿脓杆菌的最大抑菌圈直径分别为(11.17±0.22)，(11.83±0.56)，(10.33±0.22)，(11.33±0.22) mm；阳性对照对羟基苯甲酸丙酯(PP)质量浓度为1 mg/mL时，对上述4种菌的最大抑菌圈直径分别为(11.67±0.56)，(11.33±0.22)，(12.17±0.44)，(12.17±0.22) mm。本试验进一步测定了祁白术多酚对4种供试菌的最低抑菌浓度(MIC)。由表4可知，在0.25～1.00 mg/mL时，QBP对4种供试菌的抑制作用呈现明显的剂量效应，即随着多酚浓度的增加，抑菌作用随之增强。祁白术多酚对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌的MIC为0.25 mg/mL，对枯草芽孢杆菌的MIC为0.50 mg/mL。结果表明，祁白术对4种供试的革兰氏阳性细菌和革兰氏阴性细菌都有显著的抑制作用，而多酚类物质是其主要的抑菌活性成分。

图8 祁白术多酚对ABTS自由基的清除作用Figure 8 ABTS free radical scavenging ability of QBP

表4 祁白术多酚对4种菌的抑菌圈直径†Table 4 Diameter of inhibitory zone of the QBP against four common bacterial strains

† 同列不同字母表示在统计学上具有显著差异 (P<0.05)。

3 结论

祁白术多酚最佳提取工艺为：SDS添加量0.47%，超声波功率150 W，超声温度48 ℃，乙醇浓度64%，超声时间15 min，料液比1∶25 (g/mL)。在此条件下预测祁白术多酚提取量为37.79 mg/g，而经验证实验得到的实际值为(38.53±0.51) mg/g，预测值与实际值的吻合率为98.08%，说明回归模型与实际情况拟合良好，优化后的祁白术多酚提取工艺条件合理可行。本研究揭示了道地药材祁白术具有显著的抗氧化和抑菌活性，明确了多酚类物质是其发挥抗氧化、抑菌作用的药效物质基础。下一步将对祁白术多酚做进一步的分离纯化，以鉴定出祁白术多酚抗氧化、抑菌的主要活性化合物。