姚轶俊 王立峰 殷 实 徐斐然 石嘉怿 鞠兴荣

(1. 南京财经大学食品科学与工程学院，江苏 南京 210023；2. 江苏省现代粮食流通与安全协同创新中心，江苏 南京 210023；3. 江南大学食品学院，江苏 无锡 214122)

油菜的栽种历史悠久，中国作为主要的油菜生产国之一，油菜籽产量超过1.40×107t。加工处理后，会产生9.00×106t的菜籽饼粕。菜籽饼粕中不仅含有丰富的多糖、卵磷脂、维生素、微量元素等，还含有高达35%～42%的蛋白质[1]。菜籽蛋白的氨基酸组成合理，与其它植物蛋白相比，几乎不存在限制氨基酸，具有很好的营养性[2]。以菜籽蛋白为原料，经生物酶法可以得到利用率高、易吸收、抗原性低，不会产生过敏反应的小分子菜籽多肽[3]，其生物活性受到广泛关注。研究表明，菜籽多肽具有抗氧化[4-6]、抑制ACE[7]、抑制肿瘤生长等生物活性[8]，这类研究将促使菜籽多肽在功能性食品市场上有广阔的前景。

菜籽蛋白在水解制备菜籽多肽的过程中，不仅要用碱液来调节蛋白酶的最适pH值，还要通过不断的增加碱液来维持体系的pH值，导致样品中混入了大量的无机盐。此外，水解液最终色泽呈现黑褐色，干燥后的产品色泽也较深。这些因素使菜籽肽相关产品在食品、医药等领域中的应用得到限制。目前在实验室及工业生产中多肽物质的精制通常包括脱色、脱盐等步骤，常用的脱色方法是活性炭脱色，脱盐方法是大孔吸附树脂法[9]。大孔吸附树脂法，主要是通过分子间疏水相互作用有选择性地对分子进行吸附，不仅能降低其中可溶性成分，保留水解物中的疏水性肽段，而且成本较低、重复利用性好[10]。

目前针对多肽物质的脱盐工艺研究相对集中在大豆肽及小麦麦胚多肽等[11-12]。对于菜籽多肽的研究较少，而且已有研究基本集中于对分离纯化出的单一肽段进行鉴定及功能评价，如谢慧慧等[8]从菜籽粕中分离纯化出菜籽抗肿瘤肽，并结合Western Blot分析菜籽抗肿瘤肽对肿瘤细胞生长及肿瘤细胞内凋亡相关蛋白表达的影响，初步明确菜籽抗肿瘤肽的作用机理。针对菜籽肽产品本身的精制研究工艺和产物特性研究还未见报道。本试验在前期通过酶解菜籽粕制备菜籽多肽的基础上拟就菜籽多肽的精制工艺中的脱盐进行探讨，以期为后续菜籽多肽的功能性应用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

宁杂19号油菜籽粕：江苏省农业科学院所；

粉末状活性炭、凝血酶(12 IU/mL)、脂多糖 (LPS)：化学纯，北京索莱宝科技有限公司；

噻唑蓝(MTT)、二甲基亚砜(DMSO)、DMEM培养基、胎牛血清(FBS)、双抗(青霉素10 kU/mL，链霉素10 mg/mL)：分析纯，美国Gibco公司；

NO试剂盒：上海碧云天生物科技有限公司；

RAW264.7巨噬细胞：上海细胞库；

DA201-C大孔吸附树脂：郑州勤实科技有限公司。

1.2 仪器与设备

数显恒温水浴锅：HH-4型，国华电器有限公司；

纯水机：Milli-Q型，美国密理博公司；

台式冷冻干燥机：FreeZone 2.5 L型，美国LABCONCO公司；

紫外可见分光光度计：U-3900型，日本HITACHI公司；

上下摇摆摇床：TY-80B型，南京大学；

生物安全柜：1300-A型，美国赛默飞世尔科技有限公司；

CO2培养箱：250i型，美国赛默飞世尔科技有限公司；

酶标仪：SpectraMax M2e型，美国Molecular Devices公司；

氨基酸分析仪：L-8900型，日本Hittachi公司。

1.3 试验方法

1.3.1 菜籽肽粗品制备 根据实验室优化的条件，以宁杂19号油菜籽粕(由江苏省农业科学院所提供)为原料，将菜籽饼粕粉碎、脱油后，利用碱提酸沉提取菜籽分离蛋白，通过Alcalase和Flavourzyme分步水解制备菜籽蛋白水解物，Alcalase添加量6 000 IU/g，水解时间3 h；Flavourzyme添加量4 000 IU/g，水解时间2 h，制备得到菜籽肽粗品。

1.3.2 粉末活性炭脱色处理 取一定量菜籽多肽液，根据本实验室优化后的条件，采用粉末活性炭脱色。活性炭添加量2%，脱色温度60 ℃，脱色时间60 min，pH 3.5。此时，多肽脱色率为85.41%，回收率为71.54%。将脱色后的菜籽多肽冷冻干燥后于-20 ℃储藏备用。

1.3.3 DA201-C大孔吸附树脂精制工艺确定

(1) 样品浓度的影响：将脱色后的菜籽多肽配置成15，30，45，60，75 mg/mL。然后分别取一定量的菜籽多肽脱色溶液以2 BV/h流速流经层析柱，上样吸附结束后，用2 BV蒸馏水洗脱，再用50%乙醇解吸，流速与上样流速一致，洗脱2 BV后停止洗脱，旋转蒸发浓缩后，测定脱盐率和肽的回收率。取水解液5 mL，加入10%三氯乙酸溶液5 mL，静置30 min，离心20 min(8 000×g)。取1 mL 上清液加入3 mL双缩脲溶液(0.75 g无水硫酸铜和3 g酒石酸钾钠溶于250 mL 的蒸馏水，在搅拌时加入10%氢氧化钠溶液150 mL和碘化钾0.5 g，定容至500 mL)，在25 ℃条件下，静置30 min 后，在540 nm处测定吸光度。以牛血清蛋白为标准蛋白绘制标准曲线，对照标准曲线求得样品溶液中的蛋白含量(mg/mL)。按式(1)计算蛋白回收率。

(1)

式中：

c——蛋白回收率，%；

m1——菜籽蛋白水解液中蛋白含量，mg/mL；

m2——菜籽粗蛋白含量，mg/mL。

(2) 流速的影响：取一定量菜籽多肽脱色溶液，分别以1，2，3，4，5 BV/h流速流经层析柱，上样吸附结束后，用2 BV蒸馏水洗脱，再用50%乙醇解吸，流速与上样流速一致，洗脱2 BV后停止洗脱，旋转蒸发浓缩后，测定脱盐率和肽回收率。

(3) pH的影响：取一定量的菜籽多肽脱色溶液，分别调节pH为3.5，4.5，5.5，6.5，7.5，然后都以2 BV/h流速流经层析柱，上样吸附结束后，用2 BV蒸馏水洗脱，再用50%乙醇解吸，流速与上样流速一致，洗脱2 BV后停止洗脱，旋转蒸发浓缩后，按式(2)、(3)计算脱盐率和肽回收率。

(2)

式中：

c——脱盐率，%；

c1——脱盐后Cl-浓度，mg/mL；

v1——收集液体积，mL；

c2——脱盐前Cl-浓度，mg/mL；

v2——上样体积，mL，

(3)

式中：

c1——肽回收率，%；

m3——脱盐后样品多肽含量，mg/mL；

m4——脱盐前样品多肽含量，mg/mL。

(4) 解吸剂的影响：不同体积分数的乙醇解吸试验经脱色条件处理，并确定大孔吸附树脂精制工艺后，在解吸阶段分别采用体积分数25%，50%，75%，100%的乙醇解吸，经过旋转蒸发、冷冻干燥后得到4个菜籽肽组分，分别是RP25、RP50、RP75、RP100。按式(4)计算精制肽回收率。

(4)

式中：

c2——精制肽回收率，%；

m5——冻干后各组分的多肽含量，mg/mL；

m6——解吸前样品多肽含量，mg/mL。

1.3.4 产物特性测定

(1) 多肽含量：参照文献[13]。

(2) 含盐量：参照文献[14]。

(3) 灰分：按GB/T 5009.4—2003执行。

(4) 单宁含量：采用邻二氮菲—铁(Ⅲ)分光光度法[15]。称取一定量的样品溶于水中，在95 ℃中水浴1 h后，冷却至室温，过滤，将滤液移至100 mL容量瓶中并定容。从100 mL容量瓶中取稀释液1 mL于50 mL容量瓶中，分别加入0.01 mol/L的铁(Ⅲ)溶液(称取2.41 g硫酸铁铵溶于500 mL蒸馏水，并加入0.5 mL浓硫酸) 3 mL，置于80 ℃水浴25 min。冷却至室温后依次加入缓冲液(15 g冰醋酸和20 g醋酸钠溶于250 mL蒸馏水，配成pH 4.4的溶液) 4 mL、0.015 mol/L的邻二氮菲溶液(取邻二氮菲1.485 g溶于500 mL蒸馏水)6 mL、0.05 mol/L EDTA溶液(0.25 g EDTA二钠盐溶于500 mL 蒸馏水)1 mL，定容至50 mL后摇匀，静置10 min，在510 nm波长测定OD值。对照单宁标准曲线求得样品溶液中单宁的含量。

(5) 植酸含量：采用三氯化铁滴定法[16]。取2 g样品于50 mL容量瓶，采用盐酸浸提，离心后取2 mL上清液，稀释至10 mL。加入10 g/100 mL磺基水杨酸溶液2滴，用三氯化铁溶液滴定至紫色不褪去。

(6) 硫苷含量：采用氯化钯法[17]。称取样品0.1 g于10 mL 试管中，在沸水浴中干蒸10 min，加入8 mL的沸水，接着在沸水浴中蒸煮40 min，搅拌后，取出来静置冷却后，稀释至10 mL。取0.5 mL过滤后，加入 0.1%羧甲基纤维素钠2 mL，再加入氯化钯显色溶液(称取177 mg的氯化钯加入6.2%的盐酸溶液2 mL和20 mL的蒸馏水，加热溶解后定容至250 mL)1 mL，然后在24 ℃恒温箱中放置3 h，在540 nm测OD值。经换算得出硫苷含量，并以氯化钯、羧甲基纤维素钠空白溶液作为参比溶液。

(7) 产物体外抗血栓活性：酶标仪温度设置37 ℃，检测波长405 nm。不同浓度的样品溶液、凝血酶溶液和纤维蛋白溶液都以0.05 mol/L Tris-HCl和0.12 mmol/L的NaCl混合缓冲溶液配置(pH 7.2)。在96孔板里加入0.1 g/100 mL 纤维蛋白原溶液140 μL和样品溶液40 μL，混合均匀后在405 nm处读数(SB)。加入10 μL的凝血酶溶液(12 IU/mL)，启动反应10 min后，在405 nm 处读数(S)。取40 μL的缓冲液代替样品溶液，重复上述步骤，读数分别是CB和C[18]。样品凝血酶的抑制率按式(5)计算：

(5)

式中：

c0——凝血酶的抑制率，%；

C——缓冲液启动反应10 min后在405 nm处OD值；

CB——缓冲液混合均匀后在405 nm处OD值；

S——样品溶液启动反应10 min后在405 nm处OD值；

SB——样品溶液缓冲液混合均匀后在405 nm处OD值。

(6)

式中：

c——NO抑制率，%；

c1——只加入LPS(脂多糖)所产生的亚硝酸盐浓度，μg/mL；

c2——加入不同浓度样品和LPS(脂多糖)所产生的亚硝酸盐浓度，μg/mL。

(9) 产物氨基酸组成分析：取0.2 g样品置于水解管中，加入6 mol/L的盐酸，真空封口，在110 ℃条件下水解24 h。反应结束后经过滤浓缩后采用0.02 mol/mL 的HCl溶液定容至50 mL，再经0.22 μm的过滤器过滤后，采用氨基酸分析仪进行氨基酸组分的分析。

1.4 数据处理

每组试验均重复3次，结果表示为平均值±标准偏差。利用SPSS17.0统计软件进行方差分析，显著性水平为P<0.05。

2 结果与讨论

2.1 DA201-C大孔吸附树脂精制工艺研究

2.1.1 样品浓度的影响 样品浓度对脱盐率和多肽回收率的影响见图1。由图1可知，随着多肽液浓度的升高，多肽回收率呈下降趋势，当多肽液浓度>30 mg/mL时，多肽回收率下降趋势加剧。多肽液浓度较低时，肽能够与大孔树脂充分地接触，在疏水相互作用下，尽可能多地被吸附。但随多肽液浓度的降低，生产周期就会延长，图1 表明，整体上多肽液浓度对脱盐率没有明显影响。综合考虑，多肽液浓度可选择30 mg/mL。

图1 样品浓度对多肽回收率和脱盐率的影响Figure 1 Effect of sample concentration on recovery of peptide and desalination rate

2.1.2 流速的影响 流速对脱盐率和多肽回收率的影响见图2。由图2可知，洗脱流速不同对多肽回收率有显著的影响，洗脱流速1 BV/h时比5 BV/h多肽回收率高出12.02%；而整体来看，流速对脱盐率显著性不明显。因为洗脱流速3 BV/h 时比1 BV/h多肽回收率没有明显的降低，且流速越快生产周期越短，所以选择3 BV/h较为合理。

2.1.3 pH的影响 pH对脱盐率和多肽回收率的影响见图3。图3表明，pH对脱盐率影响不大，而在pH为4.5～5.5时多肽回收率较大，当pH为4.5时多肽回收率最大，可能是当pH值在蛋白质等电点时，蛋白质分子所带净电荷少，分子间的静电斥力小，吸引力增强，所以不易被水洗脱，选择pH 4.5较为合理。

图2 流速对多肽回收率和脱盐率的影响Figure 2 Effect of flow rate on recovery of peptide and desalination rate

2.1.4 解吸剂的影响 图4为不同体积分数乙醇解吸所得的多肽回收率。75%乙醇解吸所得组分的多肽回收率最高(74.40%)。随着乙醇体积分数的增加，解吸率增加，但乙醇浓度太高，达到100%时，肽类物质难以溶解，解吸液也出现了浑浊现象[19-20]。解吸时，不同体积分数乙醇的极性不同，导致与不同肽段亲和力不一样，所以以不同体积分数乙醇对菜籽肽进行洗脱，可能得到具有不同生物活性的菜籽多肽[21]。

图3 pH对多肽回收率和脱盐率的影响Figure 3 Effect of pH on recovery of peptide and desalination rate

不同字母表示差异显著(P<0.05)图4 乙醇体积分数对多肽回收率的影响Figure 4 The effect of different volume fraction of ethanol on peptide recovery

2.2 DA201-C大孔吸附树脂精制过程中解吸剂浓度对多肽功能特性的影响

不同体积分数乙醇洗脱组分的凝血酶抑制率见图5；不同体积分数的乙醇洗脱组分对LPS刺激诱导小鼠巨噬细胞RAW264.7释放NO的抑制作用见图6。抑制凝血酶催化形成纤维蛋白能力，即凝血酶抑制率可以用来评价体外抗血栓的能力。由图5可知，随着浓度的不断增加(2.5～20.0 mg/mL)，4个组分(RP25、RP50、RP75、RP100)的凝血酶抑制率也不断增加，RP25、RP50、RP75、RP100的IC50值分别是16.94，13.13，8.82，9.08 mg/mL，其中RP75的抑制凝血酶催化形成纤维蛋白的能力最强。

本试验中，采用LPS刺激诱导小鼠巨噬细胞RAW264.7释放NO的炎症模型来评价体外抗炎活性。由图6可知，RP25、RP50、RP75、RP100在0.1～0.2 mg/mL时，LPS刺激诱导小鼠巨噬细胞RAW264.7产生的NO释放量没有显著性差异(P>0.05)，RP25、RP50、RP75、RP100在0.5 mg/mL后，LPS刺激诱导小鼠巨噬细胞RAW264.7产生的NO释放量有了显著性差异(P<0.05)。RP25、RP50、RP75、RP100 抑制LPS刺激诱导小鼠巨噬细胞RAW264.7 释放NO的IC50值分别是0.97，1.01，0.80，0.78 mg/mL。结合2.1.4，精制工艺中解吸时乙醇的体积分数选择75%较为合理，此时, RP75具有良好的抗血栓活性(IC50=8.82 mg/mL)和抗炎活性 (IC50=0.80 mg/mL)。Zhong等[22]发现大豆蛋白水解物用DA201-C大孔吸附树脂处理时，经75%乙醇洗脱的组分具有最高的降胆固醇活性；Zhang等[23]研究发现草鱼鱼鳞肽经80%乙醇洗脱的组分具有最高的ACE抑制活性；Zhang等[24]认为RPH55 (DA201-C大孔吸附树脂纯化菜籽蛋白水解液时，经55%乙醇洗脱的菜籽肽组分)总抗氧化高于RPH25和RPH85，所以DA201-C大孔吸附树脂可以用不同体积分数的乙醇解吸来分离纯化肽类以满足不同功能活性的需求。

不同字母表示差异显著(P<0.05)图5 不同体积分数的乙醇洗脱组分的凝血酶抑制率Figure 5 Thrombin inhibition rate of ethanol elution components of different volume fraction

图6 不同体积分数乙醇洗脱组分对LPS诱导小鼠巨噬细胞RAW264.7释放NO的抑制作用

Figure 6 The inhibitory effect of ethanol elution components of different volume fraction on NO reaease in LPS-stimulated RAW264.7 cells

2.3 菜籽精制多肽(RP75)的基本组成

从表1来看，经DA201-C大孔吸附树脂精制后的菜籽多肽，肽含量高达74.94%，灰分含量为2.25%，单宁含量为0.60%，而植酸和硫苷均未检出。菜籽精制多肽(RP75)抗营养因子总体含量较低，肽含量较高，无机物含量较低，基本满足食用要求。

表1 菜籽精制肽的组成Table 1 Composition of rapeseed refined peptide

2.4 菜籽精制多肽(RP75)的氨基酸组成特性

从表2可以看出，菜籽精制多肽(RP75)是由丰富氨基酸组成的植物蛋白肽。菜籽精制多肽(RP75)中Glu、必需氨基酸、疏水性氨基酸以及带正电荷氨基酸含量较高，分别占氨基酸总量的16.50%，34.77%，36.10%，14.88%。研究表明，疏水性氨基酸和Glu残基含量可能在抗血栓活性方面起到了重要的作用[25-26]；带正电荷的氨基酸和疏水性氨基酸被认为在肽的抗炎活性方面起到了作用[27]，由此可以推断RP75可能具有较好的抗血栓和抗炎活性。

3 结论

本研究发现利用DA201-C大孔吸附树脂精制菜籽肽的最佳工艺条件为多肽浓度30 mg/mL，流速3 BV/h，pH 4.5，乙醇解吸浓度75%。经测定利用该方法制得的菜籽精制多肽(RP75)中抗营养因子总体含量较低，肽含量较高，有丰富氨基酸，并具有良好的抗血栓活性和抗炎活性。

表2菜籽精制多肽(RP75)的氨基酸组成†

Table 2 Amino acid composition of rapeseed refined peptide g/100 g

† 必需氨基酸(EAA)：Val、Ile、Leu、Met、Thr、Phe、Lys；疏水性氨基酸(HAA)：Met、Phe、Val、Leu、Ile、Pro、Ala；带正电荷氨基酸(PCAA)：Arg、Lys、His。

但是本研究仅通过成分分析、体外抗血栓及抗炎活性测定进行了研究，后续将在此基础上通过细胞试验及分子生物学评价手段对菜籽多肽的功能特性和作用机制进行进一步的探究，以期为其功能性应用提供理论依据。