李 梁 唐书泽 杨盼盼 刘倩妤 吴事正

(暨南大学食品科学与工程系，广东 广州 510632)

饮用水安全对居民生命健康至关重要，从饮用水供应处到食品企业和居民区经历的环节复杂[1]，存在人为投毒和突发性污染的安全隐患[2]。国家对化工污染物和农药等有毒有害试剂有很严格的管制措施[3]，但是由天然动植物毒素造成的人为投毒和突发污染易被忽视[4]。

谷物如稻谷、麦粒、玉米等在潮湿的环境下极易发霉，其中的赭曲霉在生长的过程中容易产生和积累赭曲霉毒素A (ochratoxin A，OTA)，该毒素一旦进入人体，将严重危害人体健康和生命。赭曲霉毒素A可严重损害人的肝肾[5]，致畸致癌，并且可经血液转入母乳，直接危害婴儿生命健康[6-7]。OTA分布广、毒性强，对狗和猪的口服LD50分别为0.2，1.0 mg/kg[8-9]。OTA因其方便获得和富集，容易被不法分子利用在饮用水供应系统中人为投毒，有可能导致大面积中毒等应急事件。

OTA的检测方法主要有高效液相质谱串联法[10]、薄层色谱法[11]、化学发光酶联免疫分析法[12]、纳米金核酸适配体法[13]、金标记羟胺放大化学发光法[14]等。这些方法存在设备维护昂贵、分析周期长、前处理繁琐、纳米金检测成本高、酶与适配体竞争性反应易受pH、温度等环境因素影响及难以对饮用水中OTA实现在线监测等缺点。流动注射化学发光法灵敏度高、成本低廉、易操作且可连续进样实现快速在线检测[15]，已应用于食品检测[16]、环境监测[17]和临床分析[18]等领域。本课题组前期已针对饮用水中黄绿青霉素[19]、棒曲霉素[20]等毒素开发了流动注射化学发光的快速检测方法，但由于毒素结构的差异，检测的化学发光体系也不尽相同。前期预试验表明，OTA对鲁米诺—高碘酸钠发光体系有抑制作用，但信号很弱，难以检测。本研究拟利用光信号增敏剂，建立流动注射化学发光新方法用于快速在线监测饮用水中OTA突发性污染。

1 材料与方法

1.1 主要设备与试剂

1.1.1 主要仪器设备

微弱发光测量仪：BPCL-K型，北京亚泊斯科技有限公司；

六通转换进样阀：CHEMINERT C22Z-3186型，美国VICI公司；

蠕动泵：BT100-1F型，保定兰格恒流泵有限公司；

紫外可见分光光度计：UV-3600 Plus型，日本SHIMADZU公司。

1.1.2 主要试剂

赭曲霉毒素A标准品：纯度>99.0%，美国Sigma公司；

鲁米诺、吐温20：分析纯，上海麦克林生化科技有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 进样方法 如图1所示，a、b、c、d管路分别泵入鲁米诺、样品、高碘酸钠和吐温20溶液，四通道于六通阀混合，混合溶液进入化学发光流通池中反应产生荧光。流通池中的光信号由光电倍增管PMT放大、检测，再转化为电信号由计算机分析和记录，最终以峰型图呈现。

a. 鲁米诺溶液 b. 样品溶液 c. 高碘酸钠溶液 d. 吐温20溶液 P. 蠕动泵 V. 六通转换进样阀 W. 废液池 F. 化学发光流通池 NHV. 负高压 PMT. 光电倍增管 PC. 电脑记录仪

图1 流动注射化学发光流程图

Figure 1 Schematic diagram of flow-injection CL system

1.2.2 化学发光动力学特征曲线 以吐温20为增敏剂，基于OTA对鲁米诺—高碘酸钠—吐温20发光体系的抑制作用，通过对比加入吐温20和OTA体系前后化学发光强度的变化，绘制化学发光动力学特征曲线。

1.2.3 增敏剂最适浓度选择 为探究增敏剂吐温20最适浓度，在氢氧化钠浓度0.2 mol/L，鲁米诺浓浓度6×10-4mol/L，高碘酸钠浓度5×10-4mol/L，OTA浓度0.006 μg/mL 时，考察吐温20浓度(10，20，30，40，50，60，70 mg/L)对体系化学发光强度的影响。

1.2.4 单因素试验 为探究反应条件中各因素对体系化学发光强度的作用，单因素试验依次考察氢氧化钠、鲁米诺、高碘酸钠溶液浓度对体系化学发光强度的影响。

(1) 氢氧化钠浓度选择：在吐温20浓度40 mg/L，鲁米诺浓度6×10-4mol/L，高碘酸钠浓度5×10-4mol/L，OTA浓度0.006 μg/mL时，考察氢氧化钠浓度(0.05，0.10，0.15，0.20，0.25，0.30，0.35 mol/L)对体系化学发光强度的影响。

(2) 鲁米诺浓度选择：在吐温20浓度40 mg/L，氢氧化钠浓度0.2 mol/L，高碘酸钠浓度5×10-4mol/L，OTA浓度0.006 μg/mL时，考察鲁米诺浓度(1×10-4，2×10-4，4×10-4，6×10-4，8×10-4，1×10-3，1.2×10-3mol/L)对体系化学发光强度的影响。

(3) 高碘酸钠浓度选择：在吐温20浓度40 mg/L，氢氧化钠浓度0.2 mol/L，鲁米诺浓度6×10-4mol/L，OTA浓度0.006 μg/mL时，考察高碘酸钠浓度(5×10-5，1×10-4，3×10-4，5×10-4，7×10-4，9×10-4，1.1×10-3mol/L)对体系化学发光强度的影响。

1.2.5 响应面试验设计 根据单因素试验，采用三因素三水平的响应面试验探讨反应条件氢氧化钠浓度、鲁米诺浓度、高碘酸钠浓度之间可能存在的交互作用，并对试验条件进行优化。

1.2.6 共存物干扰试验 城市饮用水中常见的无机离子和金属离子等可能会对OTA的测定有一定干扰作用，在最佳试验条件下，OTA浓度0.006 μg/mL，允许干扰误差±5%时，考察可能的共存物和常见离子对测定结果的影响。

1.2.7 标准曲线、检测限、精密度及加标回收测定 在最优试验条件下，考察OTA浓度为0.006～1.000 μg/mL时体系化学发光强度的变化，绘制标准曲线，计算检测限和精密度。分别测定宿舍饮用水、怡宝水、鼎湖山泉水中OTA的含量，并以0.05，0.50 μg/mL OTA进行加标回收测定。

1.2.8 反应机理探讨 紫外可见分光光度计分别对吐温20溶液、OTA溶液、鲁米诺—高碘酸钠溶液、鲁米诺—高碘酸钠—吐温20溶液、鲁米诺—高碘酸钠—吐温20—OTA混合溶液在200～500 nm波长范围内进行紫外吸收光谱扫描。

2 结果与分析

2.1 化学发光动力学特征曲线

如图2所示，对比曲线a、c，说明吐温20可作为敏化剂，使鲁米诺—高碘酸钠发光体系的化学发光强度显著增加。分析曲线b、c，说明OTA对鲁米诺—高碘酸钠—吐温20发光体系有抑制作用，因此选择该发光体系对OTA进行快速检测。

2.2 增敏剂最适浓度选择

随着吐温20浓度的增加，体系的化学发光强度增强(图3)。当吐温20浓度为40 mg/L时，体系的化学发光强度较大，此时峰形很好，基线稳定，当吐温20浓度继续增大时，峰形的稳定性变差，基线有一定的波动，综合考虑最佳信噪比、试剂消耗、峰形及平台区的稳定性和重现性等因素，选择最佳吐温20浓度为40 mg/L。

图2 化学发光体系动力学特征曲线Figure 2 Kinetic characteristics curve for CL system

图3 吐温20浓度对发光强度的影响Figure 3 The effect of Tween 20 concentration on chemiluminescence intensity

2.3 单因素试验

2.3.1 氢氧化钠浓度 氢氧化钠浓度会直接影响鲁米诺的氧化光反应。如图4所示，当氢氧化钠浓度为0.20 mol/L 时，体系的发光强度达到最大且较稳定，过高的氢氧化钠浓度反而会抑制发光强度，可能碱性过强会影响氧化剂的电极电位和氧化能力[21]，从而降低发光强度，因此选取氢氧化钠浓度0.20 mol/L。

2.3.2 鲁米诺浓度 鲁米诺作为发光剂会直接影响体系的化学发光强度。如图5所示，体系的化学发光强度随鲁米诺浓度的增加而增强，而鲁米诺浓度高于6×10-4mol/L 时，体系的化学发光强度增长较为缓慢，考虑试剂的消耗和环保等因素，最终选取鲁米诺的浓度为6×10-4mol/L。

2.3.3 高碘酸钠浓度 高碘酸钠作为发光体系的氧化剂，其浓度的高低会显著影响体系的化学发光强度。由图6可知，体系的化学发光强度先随高碘酸钠浓度的增大而增强，当高碘酸钠浓度为5×10-4mol/L时体系的发光强度达到最大，随着浓度继续增大，体系发光强度反而缓慢降低，因此选取高碘酸钠浓度为5×10-4mol/L。

图4 氢氧化钠的浓度对发光强度的影响Figure 4 The effect of sodium hydroxide concentration on chemiluminescence intensity

图5 鲁米诺浓度对发光强度的影响Figure 5 The effect of luminol concentration on chemiluminescence intensity

图6 高碘酸钠浓度对发光强度的影响Figure 6 The effect of sodium periodate concentration on chemiluminescence intensity

2.4 响应面试验

2.4.1 试验设计方案及结果 综合单因素试验结果，在最佳增敏剂浓度时，根据Box-Behnken中心组合设计原理，以体系化学发光强度为响应值，设计了三因素三水平的响应面优化试验。因素和水平见表1，试验方案及结果见表2，响应面回归模型方差分析结果见表3。

表1 响应面试验因素与水平Table 1 Response surface experimental factors and levels mol/L

表2 Box-Behnken试验方案和结果Table 2 Box-Behnken design and experimental results

表3 响应面回归模型方差分析†Table 3 Analysis for response surface regression model

† *表示差异显著，P<0.05；**表示差异极显著，P<0.01。

2.4.2 模型拟合和显著性检验 各因素经回归拟合后，体系化学发光强度对氢氧化钠浓度、鲁米诺浓度、高碘酸钠浓度的多元二次回归拟合方程如下：

Y=42 553.00+6 267.75A+2 423.25B+928.50C+1 950.50AB+148.50AC-126.00BC-15 830.50A2-8 240.00B2-5 731.50C2。

(1)

由表3可知，模型显著水平P值<0.000 1，说明模型的拟合效果很好，可准确描述各变量与响应值之间的关系。模型决定系数R2=0.997 0，表明预测结果和响应值结果有很好的一致性，模型校正系数RAd j=0.993 0，表示试验结果有99.30%受试验各变量的影响，说明该模型可用于分析和预测响应值结果。比较各变量对响应值的影响可知，C项为显著水平，A、B、A2、B2、C2和AB交互项均为极显著水平，说明回归模型中各因素不是简单的线性关系，存在一定的交互作用，其交互作用通过3D图和二维等高线图可直观看出，如图7 所示。

2.4.3 响应面最优条件预测和验证 结合响应面模型优化和分析预测功能，得到体系检测最佳条件为：吐温20浓度40 mg/L、氢氧化钠浓度0.21 mol/L、鲁米诺浓度6.34×10-4mol/L、高碘酸钠浓度5.16×10-4mol/L，此时体系化学发光强度为43 453。考虑实际操作的方便，将最佳检测条件修正为：吐温20浓度40 mg/L、氢氧化钠浓度0.20 mol/L、鲁米诺浓度6.0×10-4mol/L、高碘酸钠浓度5.0×10-4mol/L。在此条件下进行3次平行测定，实际体系的化学发光强度为42 596，与预测值偏差1.97%，说明响应面优化条件真实可靠。

2.5 共存物干扰试验

2.6 标准曲线、检测限、精密度及加标回收测定

在最佳条件下，对不同浓度的OTA进行梯度试验，试验表明，体系的化学发光强度(y)与OTA浓度(x)在0.006～1.000 μg/mL 时有良好的线性关系，线性方程为y=-3 101.5x+42 120，相关系数R2=0.993 1。对浓度0.2 μg/mL OTA平行测定11次，计算得到相对偏差为1.68%，说明仪器精密度良好。按照IUPAC组织的规定，以3倍的标准偏差计算方法的检测限为1.74×10-3μg/mL。在最优检测条件下，分别对宿舍饮用水、怡宝水、鼎湖山泉水进行加标回收测定，结果见表4，经计算加标回收率为80.6%～92.4%。

2.7 反应机理探讨

表4 不同水样中赭曲霉毒素A的加标回收测定结果Table 4 Obtained results for the determination of OTA in water samples(n=3)

图7 三因素交互作用的3D图和等高线图Figure 7 Three dimensional response surface and contour plots for the interaction of three factors

图8 紫外—可见吸收光谱图Figure 8 UV-Vis absorption spectrum of CL system

3 结论

本试验建立了流动注射化学发光快速在线监测饮用水中OTA的新方法，方法的线性范围为0.006～1.000 μg/mL，检出限为1.74×10-3μg/mL(S/N=3)，加标回收率为80.6%～92.4%。本法成本低、灵敏度高、可实时在线监测，适用于饮用水中OTA突发性污染的快速应急预警。但目前的研究主要针对单一毒素，对于混合毒素可考虑化学发光仪等设备的串联进行多毒素的同时在线监测，并结合核磁共振、液相质谱等方法对毒素的结构作更深入分析。