成 焕 王远亮，2

(1. 湖南农业大学食品科学技术学院，湖南 长沙 410128；2. 食品科学与生物技术湖南省重点实验室，湖南 长沙 410128)

槟榔是一种药食同源的植物，在西汉年间传入中国，有上百年的药用历史，与益智仁、砂仁、巴戟天并称为中国四大南药，主要成分为槟榔碱、多酚、脂肪、氨基酸、槟榔红色素等[1]。但近20多年来对槟榔的争议越来越大，尤其是2003年被认定为一级致癌物后，槟榔被推到了风口浪尖，现阶段研究中明晰的主要是槟榔碱的生理功效，对其他成分的研究报道相对较少[2-3]。另外人体中微生物的数量占人体总细胞数量的90%左右，其中肠道菌群数量最多，对人体的影响最为明显[4]。这些数量庞大的肠道菌群大致可以分为有益菌、中性菌及有害菌三类，它们通过一定的比例进行组合，相互制约，相互依存[5]。人体肠道菌群还能编码超过330万个基因，并在人体营养物质代谢、自身发育、免疫及疾病等方面发挥作用[6]，外肠道微生物已成为人们研究膳食因子营养功效机制普遍采用的载体。Rycroft等[7]采用肠道菌群体外发酵模式对益生菌寡糖的性质进行评价，与肠道内发酵的结果相比，两者在细菌丰度、组成和代谢产物等方面都相似。

本试验拟以肠道微生物为载体，采用间歇式静态厌氧体外发酵技术，探究槟榔籽多酚对肠道菌群的作用效果。将健康青年男性粪便作为体外发酵菌源，以对照组(C组)、添加了纯度为74.09%的槟榔籽多酚的试验组(P组)分别在体外发酵2，6，12，24 h，分析多酚物质的成分变化，发酵环境的pH值，肠道微生物多样性、菌群相对组成和生态关系等。旨在为探讨鲜槟榔籽中多酚物质调控肠道微生物提供基础研究，为槟榔药用研究提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

槟榔籽多酚：通过有机溶剂提取和大孔树脂分离，以没食子酸为标品测得纯度为74.09%的多酚提取粉末；

粪便样品：选择年龄均在24岁且饮食习惯相近的健康男性3名，要求志愿者2个月内未服用抗生素，且无肠道病史，于早饭前采集3名志愿者的粪便样品；

没食子酸(GA)标准品：纯度≥98.5%，上海瑞永生物科技有限公司；

表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)、表没食子儿茶素(EGC)、表儿茶素没食子酸酯(ECG)、表儿茶素(EC)、儿茶素(DL-C)、没食子儿茶素没食子酸酯(GCG)：标准品，美国Sigma公司；

短链脂肪酸标准溶液：乙酸、丙酸、丁酸、异丁酸、戊酸和异戊酸，美国Sigma公司；

试验用水均为超纯水。

1.2 仪器与设备

紫外—可见分光光度计：WFJ7200型，北京莱伯泰科仪器有限公司；

厌氧操作台：YQX-II型，上海跃进医疗器械厂；

厌氧培养箱：BASICI型，重庆江雪科技有限公司

高效液相色谱仪：1200型，安捷伦科技有限公司；

气相色谱仪：7890A型，安捷伦科技有限公司；

PCR热循环仪：GeneAmp®PCR System 9700系列，美国爱普拜斯公司；

台式冷冻离心机：TGL20型，长沙英泰仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 粪便处理 收集志愿者新鲜全便，各称取4 g加入36 mL 经脱氧处理的磷酸盐缓冲液(PBS，pH 7.4)进行混合，旋涡振荡3 min，配成粪便悬液，用纱布过滤，备用。

1.3.2 槟榔籽多酚体外发酵 参考并改进吴根梁等[8]体外发酵的方法，研究槟榔籽多酚对人体肠道微生物的影响。37 ℃ 条件下，模拟人体肠道厌氧环境，在发酵液中加入菌源进行静态培养，监测各发酵阶段(2，6，12，24 h)短链脂肪酸、pH值和微生物指标的变化。

基础发酵液1 L配方(pH值7.0)：蛋白胨2 g，酵母提取粉2 g，NaCl 0.1 g，K2HPO40.04 g，MgSO4·7H2O 0.01 g，CaCl2·2H2O 0.01 g，NaHCO32 g，氯化血红素0.05 g，L-半胱氨酸0.5 g，猪胆汁酸盐0.5 g，Tween-80 2 mL，维生素K110 μL。将多酚提取粉末溶于培养基中，添加10%的菌悬液，此时多酚浓度为1 g/100 mL，摇匀后置于37 ℃厌氧培养箱发酵，所有试验进行3次重复。

1.3.3 主要儿茶素单体含量测定 高效液相色谱检测条件：规格为4.6 mm×250 mm×5 μm 的 Calesil-C18液相色谱柱；柱温为35 ℃；检测波长为278 nm；进样量为10 μL；流速为1.0 mL/min。试验采用梯度洗脱，流动相A为超纯水，流动相B为体积比为40∶2∶1.5 的N，N-2甲基甲酰胺：甲醇：冰醋酸的混合液，洗脱时间及流动相变化情况为：0.01 min，80% A+20% B；15 min，72% A+28% B；28 min，60% A+40% B；32 min，60% A+40% B；35 min，80% A+20% B；40 min，80% A+20% B。用外标法计算各种成分的含量

1.3.4 pH值的测定 用pH计直接测定。

1.3.5 短链脂肪酸的含量测定 参考耿梅梅等[9]的方法，用DB-FFAP气相色谱柱(60 m×0.25 mm×0.25 μm)，流速0.8 mL/min；进样量1 μL，分流比50∶1，程序升温：初始温度60 ℃，维持2 min，以20 ℃/min升至220 ℃，保持3.5 min； 氢火焰离子化检测器，温度250 ℃，

1.3.6 Ion S5 XL 平台扩增子测序分析

(1) 样本DNA提取及PCR扩增：采用SDS方法提取样本的基因组 DNA，然后用琼脂糖凝胶电泳检测 DNA 的纯度和浓度。以检测达标的基因组DNA为模板，对样品的16S rDNA V3+V4区域进行扩增：341F(5′-CCTAYGGGRBGCASCAG-3′)，806R(5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′)，使用带 Barcode 的特异引物扩增得到相应的产物

(2) PCR 产物的混样和纯化：根据 PCR 产物浓度进行等质量混样，待充分混匀后用 1×TAE 浓度 2%的琼脂糖胶电泳纯化，剪切回收目标条带。

(3) 文库构建与测序：文库构建使用美国Thermofisher 公司的 Ion Plus Fragment Library Kit 48 rxns 建库试剂盒，然后用Qubit定量仪进行定量和文库合格检测，最后用Thermofisher公司的IonS5TMXL测序仪进行测序。

1.4 数据分析

1.4.2 Ion S5 XL 平台扩增子测序数据分析 对单端测序得到的原始数据进行质控、过滤、去嵌合体，得到有效数据[10]，然后利用Uparse软件对序列进行聚类和物种注释[11]，运用Qiime[12]和Usearch[13]软件进行样品复杂度分析，运用R[13]软件进行统计和作图。

2 结果与分析

2.1 槟榔籽多酚利用情况

由图1可以看出，2组中的多酚含量具有显著差异，变化趋势也不相同，C组中多酚含量为上升趋势，在24 h时达到最高，与2 h相比增加了477.07 μg/mL；P组则为下降趋势，2～6 h为多酚的主要利用阶段，期间减少549.47 μg/mL，利用率为18.26%。组间对比可知，不同时间段P组中多酚含量均比C组高出1个数量级以上。由数据分析可知，2组的多酚含量具有显著性差异，在酚类物质充足的条件下，肠道微生物会在前期就利用酚类物质；在酚类物质缺乏的条件下，肠道微生物可利用环境中的营养物质转化生成酚类物质。

试验还测定了生理功能比较丰富的一类酚类物质——儿茶素类。在本样品中儿茶素类占总酚含量的10%左右。由表1可知，在6 h时C组检测到少量的各类主要的儿茶素，说明肠道微生物在体外可将非其他物质转化成小分子酚类物质，供自身利用，但在12 h 时却无法检出，可知GA、EGC、DL-C、EC和EGCG被全部利用。P组中儿茶素的总体变化趋势是先增多后减少，24 h发酵液中多酚浓度较2 h增加了84 μg/mL，与C组一致。比较单体的变化趋势可发现，GA和EGC的变化趋势相似，DL-C、EC和EGCG的变化趋势相似；且前两者均在6 h陡增，后三者含量在6 h处大幅减少，推测肠道微生物中的一种或多种菌在它们的相互转化过程中起到了关键作用，与Schantz等[14]研究的绿茶中的EGCG在小肠中可分解为GA和EGC的结果相符。分析图1可知，在酚类物质充足的条件下，肠道微生物会在前期利用酚类物质，本试验中槟榔籽多酚添加量为10 mg/mL时，培养6 h后的利用率为18.26%，茶多酚的吸收在小肠部位不受其质量浓度的影响[15]，但在大肠处是否受其质量浓度的影响还有待研究。

不同小写字母表示不同时间点同组内Duncan检验差异显著，P<0.05；不同大写字母表示同一时间点不同组中Duncan检验差异显著，P<0.05

图1 槟榔籽多酚的含量变化

Figure 1 Changes of the content of areca polyphenols

2.2 发酵液中pH值的变化

C、P组的起始pH值相近都在9左右，但微生物的生长会影响pH值，检测发酵过程各阶段各发酵液的pH值，如图2 所示。

由图2可知，在24 h内C、P组的pH值均持续下降，变化趋势相似。在2 h时2组的pH差别最大，C组比P组高0.43；2～6 h时减幅最大，C组由9.17下降到7.78，P组由8.74下降到7.88；12 h时2组又回到同一水平；继续发酵到24 h，pH均小幅下降，C组减幅大于P组。数据表明槟榔籽多酚可以使pH在短时间内快速降低，但不影响24 h内的变化趋势。

2.3 短链脂肪酸含量的变化

短链脂肪酸是人体肠道菌群的发酵产物，即可以作为肠道黏膜细胞的主要能量来源，还能减少促炎症因子的产生，降低肠道炎症[16]、癌症[17]的发生。如表2所示，粪菌中微生物在24 h的体外培养中，2组变化趋势基本一致，C组中的SCFAs含量显著高于P组。以上6种短链脂肪酸的产生情况如下：其中乙酸和丙酸基本为线性增长，丁酸和异戊酸含量的增加主要在12～24 h，增量为乙酸>丙酸>丁酸>异戊酸。在培养24 h后，C组中乙酸、丙酸、丁酸和异戊酸分别提高了6.99，7.74，1.59，2.87倍；P组则分别提高4.51，5.42，1.75，1.35倍；C组比P组明显提高了1.19，1.25，0.91，2.33倍。异丁酸在C组中呈小幅增加，P组前12 h则呈小幅下降，12～24 h时回升，但仍略低于起始量。戊酸在2组中变化均不明显。以上数据表明，槟榔籽多酚不影响SCFAs的变化趋势，但会减弱乙酸、丙酸、丁酸、异戊酸的增幅，抑制其在发酵过程中的积累。比较菌群和SCFAs变化趋势发现，Parabacteroides和异戊酸含量变化趋势一致；Bacteroides、Bilophila与丁酸含量变化趋势相似，这些菌群和特定短链脂肪酸的代谢是否有关，以及作用机制还需要进一步研究。

表1 槟榔籽多酚中儿茶素类物质的含量变化†Table 1 Changes of the content of areca seed polyphenols and its main components μg/mL

† 不同小写字母表示不同时间点同组内Duncan检验差异显著，P<0.05；不同大写字母表示同一时间点不同组中Duncan检验差异显著，P<0.05；数值为0表示未检出。

不同小写字母表示不同时间点同组内Duncan检验差异显著，P<0.05；不同大写字母表示同一时间点不同组中Duncan检验差异显著，P<0.05

图2 各发酵时间段pH值变化图
Figure 2 pH values for each fermentation period

表2 短链脂肪酸(SCFAs)的含量变化†Table 2 Changes of the content of SCFAs μg/mL

† 不同小写字母表示不同时间点同组内Duncan检验差异显著，P<0.05；不同大写字母表示同一时间点不同组中Duncan检验差异显著，P<0.05；数值为0表示未检出。

2.4 发酵过程中微生物多样性分析

膳食是影响肠道微生物生长的重要因素，槟榔籽多酚通过体外发酵会引起人体肠道微生物变化。

2.4.1 门水平上肠道菌群的结构变化 为了确定微生物的变化是否主要由槟榔籽多酚引起，对样品在门水平上进行聚类分析(Unweighted Pair-group Method with Arithmetic Mean，UPGMA)，如图3所示C组的4个时间点聚在一起，P组的4个时间点也聚在一起，说明槟榔籽多酚的加入使2组产生了差异，并且组间差异大于组内差异。利用主成分分析进行验证，也得到了相同结果，可以得出后续微生物变化主要是由槟榔籽多酚加入引起的。

由图3中还可以看出，放线菌门(Actinobacteria)、厚壁菌门(Firmicutes)、拟杆菌门(Bacteroidetes)是它们共同的优势微生物。以时间为序，厚壁菌门在2组内的变化趋势一致，菌群丰度先增加后减少，P组变化幅度大于C组。

2.4.2 属水平上肠道菌群的结构变化 为找出属水平下各样本中的优势物种，选取丰度排名前35的属，根据其在每个样品中的丰度信息，从物种和样品两个层面进行聚类。如图4 所示，这35个属的细菌分属于6个优势的细菌门：19个厚壁菌门(Frmicutes)类细菌，8个变形菌门(Proteobacteria)类细菌，3个拟杆菌门(Bacteroidetes)类细菌，3个放线菌门(Actinobacteria)类细菌，1个拟杆菌门(Fusobacteria)类细菌，1个疣微菌门(Verrucomicrobia)类细菌。聚类分析结果显示，体外培养试验中C、P组的优势菌存在明显差异。槟榔籽多酚使肠道菌群中21个菌属相对丰度变化明显。

选取在属水平上相丰度排名前10的微生物进行比较，Others表示图中这10个属之外的其他所有属的相对丰度之和。如图5所示，P组中柔嫩梭菌属(Faecalibacterium)、拟杆菌属(Bacteroides)和Blautia高于C组，柠檬酸杆菌属(Citrobacter)和Parabacteroides的丰度显著低于C组。在P组中柔嫩梭菌属丰度由0.72%增加到31.79%，柔嫩梭菌类群是一种人体肠道菌群的共生菌，其很多成员具有重要的生理功能，如降解膳食纤维产生丁酸盐，高脂小鼠口服柔嫩梭菌群可减少脂肪组织炎症，增加肠道完整性[18]。拟杆菌属(Bacteroides)由相对丰度4.49% 增加到18.91%，双歧杆菌属(Bifidobacterium)也有小幅增加Blautia中的Ruminococcus_sp_5_1_39BFAA丰度由1.90%增加到8.19%。属水平上2组中的优势菌存在差异，C组中主要优势菌为柠檬酸杆菌属(Citrobacter)。对以上数据分析可知，槟榔籽多酚与已经报道的植物多酚功效并不完全一致，在短期发酵过程中可以增加物种丰度，但不会促进肠道中SCFAs的积累。

另外在属水平相对丰度排名前30的菌群中发现萨特氏菌(Sutterella)属在P组中相对丰度高于C组，并在12～24 h 时呈直线增加，LU等[19]在利用林可霉素建立致腹泻的小鼠模型时也发现，萨特氏菌在腹泻小鼠中的丰度明显比正常小鼠高，止泻后体内萨特氏菌属数量明显下降，萨特氏菌属很可能是槟榔过量食用引起腹泻的一类微生物。

图3 基于Weighted Unifrac距离的UPGMA聚类树Figure 3 UPGMA Cluster analysis diagram based on UniFrac distance matrix

图4 属水平上肠道菌群变化图(Heatmap 图)Figure 4 Changes in intestinal microflora of genus level(Heatmap)

图5 属水平上的物种相对丰度柱形图Figure 5 Histogram of relative abundance of species at genus level

3 结论

本试验从肠道微生物的角度发现高浓度槟榔籽多酚对肠道环境和肠道菌群的影响是多面的，槟榔籽多酚的加入对发酵环境的pH变化趋势无影响，但会在发酵的2～6 h时减缓环境中的pH降低，这可能是通过减缓短链脂肪酸的积累实现。同时槟榔籽多酚对肠道菌群的改变非常明显，尤其是高浓度条件下，肠道中的优势菌群会迅速发生改变，24 h内保持发酵环境中槟榔籽多酚的高浓度状态可防止菌群的自我恢复，并使柔嫩梭菌属(Faecalibacterium)一直处于优势状态。槟榔籽多酚对肠道菌群的影响与其他植物多酚相比存在差异，后续试验中会加大样本量，增加浓度变化来协助阐明这种变化产生的原因。