严士海，王 晗，李 婕，潘海敏

(江苏省中医院，南京 210029)

慢性心衰(chronic heart failure，CHF)是以心脏功能减退为特征的一系列临床综合征，尽管有多种治疗方案，CHF患者的发病率和死亡率仍然达到大流行比例，其治疗与机制研究吸引众多研究者[1-2]。细胞焦亡是一种程序性细胞死亡方式，其特征为依赖于半胱天冬酶1(Caspase 1)，并伴有大量促炎症因子的释放，在CHF中的作用受到大家关注[3-4]。参葵通脉颗粒(由炙黄芪、灵芝、淫羊藿、桂枝、丹参、黄蜀葵花等组成)是项目组传承国医大师周仲瑛教授临床经验而创制的医院制剂。前期临床与实验研究结果显示，参葵通脉颗粒总有效率90.32%，显著高于对照组的80.32%，能够抑制心肌重塑，抗免疫炎症反应[5-8]。本论文研究了参葵通脉颗粒对CHF大鼠模型心肌焦亡的影响，为其临床应用提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 动物与饲养方法

12周龄SPF级雄性SD大鼠100只，体质量(230±20) g，由扬州大学比较医学中心提供(实验动物许可证号SCXK(苏)2017-0007)。实验动物饲养于江苏省中医院实验动物中心，室温(22±2)℃，常规喂食，自由饮水，12 h/12 h光照/黑夜，相对湿度 40%～50%。动物实验遵守江苏省中医院实验动物伦理操作规程。

1.2 药物与试剂

参葵通脉颗粒组成：炙黄芪20 g，灵芝20 g，仙灵脾10 g，桂枝10 g，丹参10 g，黄蜀葵10 g，茯苓10 g，陈皮6 g，由江苏省中医院制剂部制备生产(生产批号20171012)。阳性药为盐酸贝那普利，北京诺华制药有限公司生产(批号X2632)。兔抗大鼠TLR4、NF-κB、Caspase 1、IL-1β抗体，购自abcam公司；N末端B型利钠肽原(NT-proBNP)试剂盒，购自奥森多医疗器械贸易(中国)有限公司。

1.3 造模方法

参考课题组前期实验方法[8-9]，采用肾上腹主动脉缩窄法制备CHF大鼠模型，使大鼠腹主动脉直径减少40%～50%。另取同源SD大鼠，仅游离腹主动脉但不缩窄，其他操作与模型组相同，作为假手术组。

1.4 分组与给药干预

假手术组和模型组给予等体积蒸馏水。参葵通脉颗粒低剂量组(0.72 g颗粒/kg)剂量为人临床等效剂量的1/2，参葵通脉颗粒中剂量组(1.44 g颗粒/kg)剂量为人临床等效剂量，参葵通脉颗粒高剂量组(2.88 g颗粒/kg)剂量为人临床等效剂量的2倍，阳性药组(贝那普利，0.9 mg/kg)剂量为人临床等效剂量。造模成功后，根据上述分组灌胃给于相应组别药物共4周。

1.5 检测指标

1.5.1 心功能检测 大鼠禁食不禁水过夜，末次给药后2 h称体质量(g)，然后将大鼠以异氟烷吸入性麻醉后，应用小动物高频彩色超声系统(加拿大VISUALSONICS)测量左室射血分数(left ventricle ejection fraction, LVEF)和缩短分数(fractional shortening, FS)，测定值为3个心动周期的均值。

1.5.2 标本采集 检测大鼠血流动力学参数后，从颈总动脉采集2 mL血液，3000 r/min、10 min离心分离血清以备检测；然后快速剪开胸腔取出心脏，用生理盐水清洗2次滤纸吸干，沿房室沟剪掉两心房、主动脉和肺动脉，紧贴室间隔右侧剪下右心室游离壁，剩余部分即为左心室。沿着左心室中部横向切取0.5 cm厚的心肌组织置于4%多聚甲醛中固定以备染色。剩余左心室组织包于锡纸中，标记并立即放入液氮速冻24 h，然后置于-80 ℃冰箱贮藏，用于Western blot等检测。

1.5.3 NT-proBNP检测 样本送医院检验科，使用强生Vitro5600全自动生化免疫分析仪检测NT-proBNP。

1.5.4 TUNEL染色 经过固定的组织梯度乙醇脱水，二甲苯透明，石蜡包埋切片，按照试剂盒说明严格进行操作。用TUNEL法检测心肌细胞程序性坏死，以细胞核染成棕褐色为阳性结果，每组每个心肌标本各取1张切片，每张切片计数5个高倍视野(×400)，计算心肌细胞TUNEL 蛋白指数(阳性细胞数/总细胞数)。

1.5.5 western blot检测TLR4、NF-κB、caspase1、IL-1β的表达 根据说明书提取左心室总蛋白，采用BCA 法定量蛋白。采用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳将蛋白转移至聚偏二氟乙烯膜，染色观察条带，缓冲溶液洗膜，采用封闭液封闭1 h，分别加兔抗大鼠TLR4、NF-κB、Caspase 1、IL-1β抗体稀释液室温孵育2 h，缓冲溶液洗膜，加二抗反应1 h，缓冲溶液洗膜，ECL 发光试剂发光。采用凝胶图像分析系统进行吸光度扫描，将TLR4、NF-κB、Caspase 1、IL-1β蛋白条带的吸光度与β-actin比值作为蛋白表达值进行比较。

1.6 统计学方法

2 结果

2.1 参葵通脉颗粒对CHF大鼠模型LVEF与FS的影响

表1显示，与假手术组比较，模型组大鼠 LVEF与FS显著降低；与模型组比较，参葵通脉颗粒低、中、高3个剂量组LVEF与FS明显增加。

表1 参葵通脉颗粒对CHF大鼠LVEF与FS的影响

注：与假手术组比较：*P<0.05；与模型组比较：#P<0.05

2.2 参葵通脉颗粒对NT-proBNP的影响

表2显示，与假手术组比较，模型组NT-proBNP显著升高(P<0.05)；与模型组比较，参葵通脉颗粒低、中、高3个剂量组NT-proBNP显著降低(P<0.05)。

2.3 参葵通脉颗粒对心肌TUNEL染色的影响

表2图1显示，与假手术组比较，模型组大鼠TUNEL染色阳性细胞(棕色颗粒)显著增加(P<0.05)；与模型组比较，参葵通脉颗粒各组TUNEL染色阳性细胞显著降低(P<0.05)。

2.4 参葵通脉颗粒对TLR4、NF-κB、Caspase 1、IL-1β的影响

表3显示，与假手术组比较，模型组TLR4、NF-κB、Caspase 1、IL-1β蛋白表达水平显著升高；与模型组比较，参葵通脉颗粒各组TLR4、NF-κB、Caspase 1、IL-1β蛋白表达水平显著下降。

表2 参葵通脉颗粒对CHF大鼠NT-proBNP、TUNEL蛋白指数的影响

注：与假手术组比较：*P<0.05；与模型组比较：#P<0.05

注：a.假手术组；b.模型组；c.参葵通脉颗粒低剂量组；d.参葵通脉颗粒中剂量组；e.参葵通脉颗粒高剂量组；f.贝那普利组图1 各组心肌TUNEL染色比较(×400)

3 讨论

根据CHF临床症状，国医大师周仲瑛提出[10]CHF治疗应当辨别虚实标本，其病理发展则多为心气虚弱、心阳不振、气虚阳衰、血瘀水停。由此可知，“气阳亏虚”是心力衰竭的病理基础，“心脉瘀滞”是心力衰竭的中心环节，并以心气(阳)亏虚、血瘀(水停)为其病理变化的主要方面。项目组传承周仲瑛教授的临床经验，创制参葵通脉颗粒——以益气(温阳)、化瘀(利水)为主要功效的中药复方制剂。

本研究复制CHF大鼠模型发现，与假手术组比较，模型组NT-proBNP显著上升，LVEF与FS明显下降，说明大鼠心肌功能受损，CHF模型复制成功[11]。经过药物治疗后，与模型组比较参葵通脉颗粒各组NT-proBNP明显下降，LVEF与FS显著上调，说明参葵通脉颗粒对CHF大鼠模型心肌功能损伤具有良好的改善作用。

细胞焦亡是一种主要由Caspase 1介导的程序性细胞死亡模式，与凋亡特征相似的地方是焦亡过程中DNA断裂和TUNEL染色呈阳性。与细胞凋亡过程中细胞膜完整和凋亡小体形成的过程不同，焦亡一般伴随着大量的免疫炎症因子与细胞内容物的释放。本实验TUNEL染色结果显示，参葵通脉颗粒对心肌细胞程序性死亡具有较好的抑制作用。Caspase 1与IL-1β是细胞焦亡过程中重要的炎症因子，IL-1β在CHF的发病过程中起到非常重要的作用，一方面能诱发心肌细胞肌浆网中的钙离子外流，直接影响钙离子的内环境以及心肌细胞兴奋-收缩偶联，使心肌收缩功能受损；另一面还能引起细胞死亡和组织重塑，导致心衰发生[12-14]。实验结果显示，参葵通脉颗粒能够显著降低CHF大鼠模型心肌组织中Caspase 1与IL-1β水平，说明参葵通脉颗粒可能通过调控心肌细胞焦亡，发挥益气温阳、化瘀利水的作用，进而干预CHF抑制心肌重构的病理过程，达到防治CHF的效果。Toll样受体是细胞膜上的分子模式识别受体，当细胞受到氧化应激或体内神经内分泌紊乱等刺激时，TLR4能够识别内环境的变化，通过NF-κB促进caspase-1、IL-1β前体的表达[15-16]。本研究观测到，模型组大鼠心肌TLR4、NF-κB表达显著增加，与其他研究者结果一致，而且结果显示参葵通脉颗粒可以一定程度上抑制TLR4、NF-κB的表达。实验结果表明，参葵通脉颗粒既可以从源头上抑制caspase-1、IL-1β前体的产生，也可以抑制caspase-1、IL-1β的活化。

综上所述，参葵通脉颗粒对CHF大鼠模型心功能与心肌重塑具有良好的改善作用。CHF大鼠心肌细胞焦亡明显增加，参葵通脉颗粒对CHF大鼠心肌细胞焦亡及焦亡通路相关蛋白的表达具有一定的抑制作用，这可能与其治疗CHF、减轻心肌重塑密切相关。

表3 参葵通脉颗粒对TLR4、NF-κB、Caspase 1、IL-1β的影响

注：与假手术组比较：*P<0.05；与模型组比较：#P<0.05