丁浩 安超 薛文娇

摘要：对分离自野生冬虫夏草（Cordyceps sinensis）的一株真菌F4539进行形态学和分子生物学鉴定，并对其发酵产物进行抗氧化活性研究。结果表明，F4539（Genbank号为KU359775）与Hirsutella sinensis（AJ309355）具有99%的相似性，初步确认F4539为中华被毛孢（Hirsutella sinensis）。抗氧化活性试验结果表明，F4539发酵物20 g/L乙醇提取液的DPPH抗氧化活性为75.39%，高于同浓度国产某商品化冬虫夏草菌菌丝体胶囊乙醇提取物的抗氧化活性，进一步研究表明，F4395发酵物和国产某商品清除DPPH自由基的IC50分别为5.96 g/L和11.61 g/L，即F4539发酵提取物清除DPPH自由基的能力强于国产某商品。

关键词：冬虫夏草（Cordyceps sinensis）；中华被毛孢（Hirsutella sinensis）；抗氧化

中图分类号：S567.3+5 文献标识码：A

文章编号：0439-8114（2019）03-0057-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2019.03.016 开放科学（资源服务）标识码（OSID）：

Abstract： A fungus numbered F4539 was isolated from wild Cordyceps sinensis and identified by morphology and molecular biological identification， in addition， the antioxidant activity for the fermentation products were studied. The results demonstrated that F4539（Genbank： KU359775） had relatively high similarity in evolution with Hirsutella sinensis（AJ309355）， it was confirmed that F4539 was Hirsutella sinensis； Antioxidant activity tests showed that the DPPH antioxidant activity was 75.39% with a concentration of 20 g/L ethanol extract from F4539 fermentation products， which was higher than the same concentration of ethanol extracts from the certain commercial Cordyceps sinensis mycelium capsule. Further research showed that the IC50 of F4539 fermentation products and commercial Cordyceps sinensis mycelium capsule were 5.96 g/L and 11.61 g/L respectively. It was shown that the antioxidant activity was higher in F4539 fermentation products than the commercial Cordyceps sinensis mycelium capsule.

Key words： Cordyceps sinensis； Hirsutella sinensis； antioxidant

冬虫夏草（Cordyceps sinensis）隶属麦角菌科虫草属，是鳞翅目蝙蝠蛾科蝠蛾屬幼虫被中华被毛孢（Hirsutella sinensis）寄生后形成的虫菌复合体，为中国的珍贵中药材之一，具有抗菌、抗肿瘤、抗氧化、免疫调节等功效[1]。它分布于中国青藏高原的西藏、青海、四川、甘肃和云南等地以及印度、尼泊尔和不丹等国的部分地区。主产于西藏的那曲、林芝、昌都地区，青海的玉树、果洛州一带，四川的阿坝州、甘孜州，云南迪庆州德钦、中旬以北一带以及甘肃省甘南州玛曲以西等地。由于野生冬虫夏草分布地区狭窄、自然寄生率低、对生活环境条件要求苛刻，所以本身资源比较有限，再加上自然因素（如天气干旱、气候变暖等），天然资源日益匮乏。

近年来由于冬虫夏草主产地生态环境遭到人为破坏，大量盲目不合理采挖致使资源日趋减少，产量逐年下降，导致天然冬虫夏草的价格昂贵，自20世纪以来，人们开始探索用人工方法培育仿冬虫夏草。迄今为止，深层发酵研究已取得了较大的进展，且生产出的替代品（如菌丝体）的成分和药效也与天然虫草相似[2]。中华被毛孢已经被证实为冬虫夏草的无性型[3，4]。

由于冬虫夏草的全人工培养技术尚未成熟，现阶段人们采用发酵冬虫夏草菌无性型中华被毛孢，通过提取菌丝活性成分替代天然冬虫夏草的药用价值，而由于此前关于冬虫夏草无性型的争议，导致多数研究冬虫夏草菌的发酵试验中的菌种不是中华被毛孢。因此，在通过发酵法生产冬虫夏草替代品的产业化前进行菌株的筛选、鉴定及生物活性测定非常重要。本试验对前期分离自野生冬虫夏草的一株真菌F4539进行了形态学和分子生物学鉴定，结果表明其为中华被毛孢，同时研究了其发酵产物的抗菌和抗氧化活性，旨在为进一步产业化的开发提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

F4539菌株，从野生冬虫夏草中分离选育获得，在-80℃超低温冰箱保存。

活化培养基：蔗糖50 g/L，胰蛋白胨10 g/L，酵母粉3 g/L，无水氯化钙0.3 g/L，磷酸二氢钾1.0 g/L，七水硫酸镁0.5 g/L，氯化钠1.0 g/L，五水硫酸铜0.01 g/L，七水硫酸亚铁0.01 g/L，四水氯化锰0.01 g/L，二水氯化锌0.01 g/L，琼脂16 g/L，pH 5.6～6.0。

种子培养基、发酵培养基和不加琼脂的活化培养基。

指示菌培养基为商品化营养琼脂（北京澳博星生物科技公司）。

其他试剂：无水乙醇，DPPH（Sigma）。

1.2 仪器与设备

BSA224S万分之一天平（Sartorious），UB-7型pH测定仪（Sartorious），5804R离心机（Eppendorf），SW-CJ-2FD超净工作台（苏净安泰），HUA-85型灭菌锅（HIRAYAMA），ZHWY-2012型恒温摇床（上海智诚科技有限公司），BX41型显微镜（OLYMPUS），Synergy H1型多功能酶标仪（BioTek），Gel DocTM型凝胶成像系统（Bio-RAD），2720 Thermal cycle型PCR仪（Applied Biosystems）。

1.3 方法

1.3.1 菌种活化与发酵培养 -80 ℃保藏的菌种接种至活化培养基，于18 ℃培养45 d，将活化好的菌种接种于装有50 mL种子培养基的250 mL三角瓶中于18 ℃、180 r/min条件下培养20 d，然后按照5%接种量进行扩大培养，培养温度18 ℃，培养时间20 d。

1.3.2 分子生物学鉴定 取培养20 d的种子液，离心获得菌体，通过液氮研磨后，采用TaKaRa MiniBEST Universal Genomic DNA Extraction Kit Ver. 5.0（Code No. 9765）提取总DNA。PCR选用真菌鉴定常用引物ITS1（5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′）和ITS4

（5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′），PCR扩增反应体系（50 μL）为10×Extaq buffer 5 μL，dNTP （800 μmol/L） 4 μL，Primer ITS1 （10 ng/μL） 2 μL，Primer ITS4（10 ng/μL） 2 μL，DNA模板（50 ng/mL） 5 μL，Extaq酶（5 U/μL） 0.5 μL，ddH2O 31.5 μL。PCR反应程序为94 ℃预变性5 min；94 ℃变性1 min，56 ℃复性1 min，72 ℃延伸2 min，共进行30个循环；72 ℃延伸5 min。回收目的片段，测序工作由华大基因（北京）有限公司完成。将所测序列使用MEGA 5.05中的Clustal W功能进行相似序列的比对，同时采用邻接法（Neighbor-Joining）构建该菌株的系统进化树。

1.3.3 发酵提取物清除DPPH自由基活力测定

①DPPH溶液的配制。准确称取20 mg DPPH，用95%乙醇定容于250 mL容量瓶中，得到浓度为0.2 mmol/L DPPH，避光保存（0～4 ℃）备用；②样品乙醇提取物准备。准確称取0.1 g的提取物，加入5 mL 95%乙醇，超声波提取1 h，8 000 r/min离心取上清液即为样品乙醇提取物。③DPPH自由基清除率的测定方法。样品乙醇提物2 mL及0.2 mmol/L DPPH溶液2 mL加入同一具塞试管中振荡摇匀30 min后，测定在517 nm波长的吸光值Ai；测定2 mL 0.2 mmol/L DPPH溶液与2 mL 95%乙醇溶液混合后的吸光值Ac；测定2 mL样品乙醇提物与2 mL 95%乙醇溶液混合后的吸光度Aj，重复3次。根据公式SR=[1-（Ai-Aj）/Ac]×100%计算清除率SR[5]。

1.3.4 数据分析 所有的检测都设置3次重复，数据通过Origin Pro 8（OriginLab Corporation，Northampton，USA）软件进行方程拟合。

2 结果与分析

2.1 菌株的菌落及显微特性

根据目前的研究报道[6]，结合作者先前的研究，确定该分离菌株的生长温度为18 ℃。在活化培养基培养10 d后，与培养基接触处的接种体萌生稀疏的菌丝（图1A），随后菌落慢慢形成，在培养30 d以后接种体变成黑褐色，菌落开始隆起并生成黄褐色或灰白色褶皱，部分菌落的表面有多糖分泌出来（图1B）。挑选生长期的该菌株，制片进行观察，如图1C和图1D所示，F4539在固体培养条件下，气生菌丝由初级菌丝出芽生长形成次级菌丝，菌丝体无色，有隔膜，次级菌丝还可能再次分叉。在次级菌丝的顶端形成分生孢子梗，而后分生孢子梗顶端特化，逐渐生长膨胀形成瓶梗结构，瓶梗结构可经基部分裂形成分生孢子。这些特征与冬虫夏草菌（Cordyceps sinensis）的描述基本一致[7]。

2.2 菌株分子生物学鉴定

对该菌株进行分子生物学鉴定。通过对PCR扩增产物进行凝胶电泳检测（图2），推测获得的序列长度为500～750 bp，基因测序由华大基因（北京）有限公司完成，其所测ITS序列长度为616 bp，并提交GenBank生物数据库，注册登录号为KU359775。通过对该序列进行Blast比对，选择与其相似性高的序列进行系统发育树构建，如图3所示。其中，F4539（KU359775）与Ophiocordyceps sinensis voucher HMAS 173835（EU570946）、Hirsutella sinensis L95DBM-1（AJ309355）和Cordyceps sinensis voucher L95D04（RZ）（AJ309354）具有99%的相似性。2005年10月29日，中国菌物学会在北京召开了“冬虫夏草及其无性型研讨会”，确认冬虫夏草的学名是Cordyceps sinensi （Berk.） sacc.或Ophiocordyceps sinensis，其无性型是中华被毛孢（Hirsutella sinensis），异名有蝙蝠蛾多（被）毛孢（Hirsutella hepiali）、中华束丝孢（Synnematium sinense）。因此可以确定，F4539为冬虫夏草菌的无性型中华被毛孢（Hirsutella sinensis）。

2.3 冬虫夏草菌发酵物的抗氧化活性

对冬虫夏草菌F4539的发酵提取物进行抗氧化活性测定，并与国产某商品化冬虫夏草菌菌丝体胶囊的提取物进行抗氧化活性对比，结果（图4）表明，冬虫夏草菌F4539发酵物20 g/L乙醇提取液的DPPH抗氧化活性为75.39%，明显高于同浓度国产某商品提取物的抗氧化性的53.51%，这可能与处理工艺不同有关。本试验在样品处理过程中使用低温培养、冷冻干燥，极大地降低了抗氧化活性的损失。到目前为止，对冬虫夏草的抗氧化活性的研究已有大量的报道，大多数以野生冬虫夏草为研究材料，但对无性型菌株发酵产物的抗氧化研究较少[8，9]。

为了进一步比较冬虫夏草菌F4539发酵物及国产某商品化冬虫夏草菌丝体胶囊乙醇提取物浓度与清除DPPH自由基能力的量效关系，以菌丝体20 g/L的乙醇提取物为基准，按照2倍系数逐级稀释获得20.00、10.00、5.00、2.50、1.25、0.63、0.31、0.16 g/L的乙醇提取物，测其对DPPH自由基清除率。随着乙醇提取物浓度的增加，冬虫夏草菌F4539发酵物及国产某商品化冬虫夏草菌丝体胶囊乙醇提取物对DPPH自由基清除率增强，F4539菌丝体提取物和商品化菌丝体胶囊DPPH清除率对浓度的响应曲线如图5所示，在试验设计浓度范围内，提取物清除自由基能力与浓度呈明显的量效关系，其IC50分别为5.96和11.61 g/L，证明F4539发酵提取物的抗氧化活性优于某商业化产品，具有进一步开发的潜力。

3 结论

目前，对冬虫夏草发酵的研究主要集中在菌株筛选、发酵优化和发酵产物活性评价及应用几个方面。其中确定菌株是否为冬虫夏草无性型中华被毛孢成为最关键的问题之一。因此，在对冬虫夏草的研究之前对菌株进行鉴定是很有必要的，而分子生物学方法是鉴定冬虫夏草无性型的最有效方法之一。本研究采用形态学和分子生物学鉴定手段证明菌株F4539（KU359775）为冬虫夏草菌的无性型中华被毛孢（Hirsutella sinensis）。抗氧化活性试验表明，F4539菌丝体提取物和商品化菌丝体胶囊对DPPH清除率与浓度呈明显的量效关系，其IC50分别为5.96 和11.61 g/L，证明F4539发酵提取物的抗氧化活性优于某商业化产品。因此，冬虫夏草菌F4539具有进一步开发的潜力。

参考文献：

[1] YAN J K，WANG W Q，WU J Y. Recent advances in Cordyceps sinensis polysaccharides：Mycelial fermentation，isolation，structure，and bioactivities：A review[J].Journal of Functional Foods，2014，6：33-47.

[2] LIU Z Q，LIN S，BAKER P J，et al. Transcriptome sequencing and analysis of the entomopathogenic fungus Hirsutella sinensis isolated from Ophiocordyceps sinensis[J].BMC Genomics，2015，16（1）：106-123.

[3] LIU Z Y，LIANG Z Q，LIU A Y，et al. Molecular evidence for teleomorph-anamorph connections in Cordyceps based on ITS-5.8S rDNA sequences[J].Mycol Res，2002，106（9）：1100-1108.

[4] CHEN Y Q，WANG N，QU L H，et al. Determination of the anamorph of Cordyceps sinensis inferred from the analysis of the ribosomal DNA internal transcribed spacers and 5.8S rDNA[J].Biochem Syst Ecol，2001，29（6）：597-607.

[5] 段琦梅，梁宗鎖，聂小妮，等.黄芪和党参提取物的抗氧化活性研究[J].西北植物学报，2010，30（10）：2123-2127.

[6] DONG C H，YAO Y J. Nutritional requirements of mycelial growth of Cordyceps sinensis in submerged culture[J].Journal of Applied Microbiology，2005，99（3）：10.

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[9] 姜微哲，渠 凯，朱海波.冬虫夏草提取物调血脂与抗氧化活性[J].中国实验方剂学杂志，2011，17（12）：127-131.