液质联用法同时测定婴幼儿配方乳粉中氯酸盐和高氯酸盐残留

2019-03-25王浩贾婧怡张杉张旭陈江龙赵丽

中国乳品工业 2019年2期

王浩，贾婧怡，张杉，张旭，陈江龙，赵丽

（国家食品质量安全监督检验中心，北京100094）

0 引言

在食品的生产、包装过程中，为抑制微生物的生长繁殖，需要频繁对食品的原料、生产设备进行清洗消毒，其中氯酸盐和高氯酸盐作为消毒副产物极有可能会在婴幼儿配方乳粉中存在残留，引发食品安全隐患。一旦婴幼儿体内的高氯酸盐过量，会出现智商偏低、学习障碍、发育迟缓、多动症、注意力分散甚至弱智等症状。氯酸盐为中等毒性化合物。由于国家目前还未制定相关限量标准，所以对婴幼儿配方乳粉中氯酸盐和高氯酸盐残留进行监控有着重要的现实意义。

目前,测定氯酸盐和高氯酸盐的方法主要有离子色谱法[1-2]、离子色谱-质谱法[3－7]和高效液相色谱-质谱法等[8－11]。但应用液相色谱-质谱联用法同时检测婴幼儿配方乳粉中氯酸盐和高氯酸盐相关报道比较少见。本文采用水超声溶解，乙腈除蛋白，正己烷除脂，内标法定量，采用高效液相色谱串联质谱仪进行检测,前处理简单，灵敏度高，适合于婴幼儿配方乳粉中氯酸盐和高氯酸盐的同时快速检测。

1 实验

1.1 仪器与试剂

Agilent 6410型串联三重四极杆质谱仪：配电喷雾源（ESI）和Agilent1200型液相色谱仪；GL-88型涡旋混合器；KQ-5200型超声波清洗仪。

氯酸盐和高氯酸盐标准品；氯酸盐-18O3（200μg/mL）和高氯酸盐-18O4（100μg/mL）标准溶液；乙腈、正己烷和乙酸铵（均为HPLC级）；样品：作者单位检验样品；实验用水为Milli-Q纯水仪制备的超纯水（≥18 MΩ·cm）。

1.2 标准溶液的配制

标准储备液：准确称取128 mg的氯酸钠标于100 mL容量瓶中，用超纯水溶解并定容至刻度，制成质量浓度为1 mg/mL的氯酸盐标准储备液，4℃保存；准确称取123 mg的高氯酸钠标于100 mL容量瓶中，用超纯水溶解并定容至刻度，制成质量浓度为1 mg/mL的高氯酸盐标准储备液，4℃保存。

中间质量浓度标准溶液：用超纯水将标准储备液配制成氯酸盐和高氯酸盐质量浓度分别为2μg/mL和0.2μg/mL的中间质量浓度标准溶液，4℃保存。

中间质量浓度内标溶液：用超纯水将氯酸盐-18O3（200μg/mL）和高氯酸盐-18O4（100μg/mL）标准溶液制成氯酸盐和高氯酸盐质量浓度分别为5μg/mL和1μg/mL的中间质量浓度内标标准溶液，4℃保存。

基质标准校准溶液：称取阴性样品,先加入20μL的中间质量浓度内标溶液，再加入适量的中间质量浓度标准溶液，使氯酸盐最终添加质量浓度分别为分别为20，50，100，200，500 ng/mL；高氯酸盐最终添加质量浓度分别为分别为2，5，10，20，50 ng/mL。其余处理同1.3。

1.3 样品前处理

称取1.0 g样品,精确至0.01 g，置于10 mL具塞比色管中，依次加入氯酸盐和高氯酸盐内标工作液20μL，加入2 mL温度60～70℃热水，涡旋30 s后，再加入3 mL乙腈，具塞振摇使蛋白质沉淀，超声提取10 min，吸取1 mL上清液用4 mL乙腈饱和的正己烷液液分配，除去脂肪，过0.20μm有机滤膜后，液相色谱-串联质谱测定。

1.4 色谱-质谱条件

液相色谱条件为色谱柱：资生堂PC HILIC柱为2.0 mm×150 mm，5μm；流速为0.20 mL/min；柱温为25℃；进样量为3μL；流动相乙腈（A相）和浓度为50 mmoL/L的乙酸铵水溶液(B相)=85+15，体积比。

质谱条件为电喷雾离子源（ESI）；扫描方式为负离子模式；检测方式为多反应检测；干燥气为N2；雾化气压力为275.8 kPa；干燥气温度为340℃；干燥气流速为8 L/min；定性离子对、定量离子对及碰撞能量如表1所示。内标法定量。

表1 氯酸盐和高氯酸盐的质谱参数

2 结果与讨论

2.1 样品前处理方法的优化

氯酸盐和高氯酸盐都易溶于水，同时，考虑到乳粉基质复杂，富含脂肪和蛋白质，所以本方法在样品中先分别加入2 mL温度为60～70℃热水、氯酸盐和高氯酸盐同位素内标，涡旋1 min，使样品中氯酸盐和高氯酸盐充分溶解，再加入3 mL乙腈，去除样品中蛋白质，再用乙腈饱和的正己烷除脂。这种前处理的方法简便快速，氯酸盐和高氯酸检出限低（分别为10 μg/kg和1μg/kg），加标回收率高（平均加标回收率＞85%），可以完全满足实际检测要求。

2.2 质谱条件的优化

采用直接进样方式分别将质量浓度为200 ng/mL的氯酸盐、氯酸盐-18O3、高氯酸盐和高氯酸盐-18O4等4种化合物用蠕动泵注入离子源中，在电喷雾负离子方式下进行一级质谱分析(Q 1扫描)，得到分子离子，即母离子。由于氯酸盐分子量较小，碎裂电压较高时，[M-H]-分子离子峰易断裂，造成离子化效率不高，因此，本方法选择碎裂电压为30V，同理，氯酸盐-18O3、高氯酸盐和高氯酸盐-18O4碎裂电压分别为40，70，50V；再对化合物的分子离子进行二级质谱分析(子离子扫描)，得到碎片离子信息，即子离子；然后优化4种目标化合物的二级质谱参数，得到每种化合物的二级质谱图；按照二级质谱图提供的碎片离子信息，选择4种目标化合物的定性和定量离子，得到氯酸盐、氯酸盐-18O3、高氯酸盐和高氯酸盐-18O4等4种化合物的最佳质谱参数，结果如表1所示。

2.3 色谱条件的优化

2.3.1 色谱柱的选择

为了有利于色谱峰的分离及锋形的改善，本研究分别采用资生堂MGⅢ-C18色谱柱(150 mm×2.1 mm,5μm)、资生堂PC HILIC柱色谱柱(150 mm×2.0 mm,5μm)和Atiantis HILIC Silica色谱柱(100 mm×2.1 mm,3μm)进行分离试验，发现资生堂PC HILIC柱色谱柱(150 mm×2.0 mm,5μm)效果较好,氯酸盐和高氯酸盐的峰形及灵敏度均优于其余两款色谱柱。

2.3.2 色谱分离条件选择

由于PC HILIC色谱柱一般都采用乙腈-乙酸铵水溶液作为流动相。首先比较了乙腈和浓度为10 mmoL/L的乙酸铵水溶液、20 mmoL/L的乙酸铵水溶液、30 mmoL/L乙酸铵水溶液、40 mmoL/L乙酸铵水溶液、50 mmoL/L乙酸铵水溶液的色谱行为，发现乙酸铵水溶液浓度越高时，氯酸盐的色谱峰重现性越好；比较了乙腈和浓度为50 mmoL/L的乙酸铵水溶液比例分别为70∶30，80∶20，85∶15，90∶10和95∶5；发现乙腈和浓度为50 mmoL/L的乙酸铵水溶液比例为85∶15，3 min内氯酸盐和高氯酸盐能得到有效分离，其他比例氯酸盐和高氯酸盐均不能有效分离（结果如图1所示）。

2.3.3 进样量的选择

进样量大可提高测定的灵敏度,但是容易污染色谱柱。实验发现,当进样量达到3μL时,灵敏度能达到要求，且对色谱柱影响不大。

2.4 线性范围与检出限

乳粉富含油脂蛋白质，为了消除测定液中存在的基质效应，本研究首先在前处理过程中采取除油和除蛋白处理，同时采用空白样品加标内标法配制的基质工作曲线，极大程度消除测定中的基质效应，同时又明显提高了定量的准确性。用基质标准校准溶液，分别进样3μL，测定结果经线性回归（y为峰面积；x为质量浓度，μg/L），同时用空白样品进行加标实验，同时用空白样品进行加标实验，在信噪比均大于3的条件下能检出，将此添加量定为检出限，在信噪比均大于10的条件下能检出，将此添加量定为定量限。结果如表2所示。)

表2 氯酸盐和高氯酸盐的线性方程、线性关系、相关系数、定量限及检出限 μg/kg

2.5 方法的回收率和精密度

每组准确称取空白样品6份，每份1.0 g,共3组，分别定量加入目标标准物质，第一组添加水平：氯酸盐质量分数为20μg/kg，高氯酸盐质量分数为2.0μg/kg；第二组添加水平：氯酸盐质量分数为40μg/kg，高氯酸盐质量分数为4.0μg/kg；第三组添加水平：氯酸盐质量分数为200μg/kg，高氯酸盐质量分数为20.0μg/kg。

按供试品溶液制备方法制备后进行测定,结果如表3所示。由表3可以看出，不同质量分数平均加标回收率85.1%～94.7%，平均相对标准偏差为2.38%～9.79%（n=6）。图1为加标样品中MRM色谱图。

表3 氯酸盐和高氯酸盐的加标回收率 %

图1 氯酸盐和高氯酸盐的加标MRM色谱

2.6 实际样品检测

利用本方法对市场销售的50种婴幼儿营养乳粉进行检测，其中37个样品检出氯酸盐（质量分数范围为22.7～1813μg/kg，检出率74.0%），47个样品检出高氯酸盐（质量分数范围为2.37～400μg/kg，检出率94.0%）。上述结果表明，婴幼儿营养乳粉中确实存在氯酸盐和高氯酸盐残留，其对婴幼儿健康存在的风险应当引起重视。