王海利，张晓慷，王滢秀，韩金涛，张新刚

（山东省农药科学研究院/山东省化学农药重点实验室，山东济南 250100）

白粉病别称白毛病，是一种广泛发生的世界性病害。在我国，夏秋露地和春保护地黄瓜每年都因白粉病的发生造成大量减产［1］。黄瓜白粉病是由葫芦科白粉菌（Erysiphecucur bitacearum）或单丝壳白粉菌（Sphacrotheca fuliginea）引起的［2］，病原菌主要通过气流传播，具有潜育期短、再侵染频繁、流行性强等特点［3］。目前，防治白粉病的主要手段是化学杀菌剂，但由于白粉病病菌繁殖率很高，同一流行季节可繁殖多代，加之内吸性杀菌剂大多作用位点单一，病菌在药剂的选择压力下极易产生抗药性，国内外已有黄瓜白粉病病菌对苯并咪唑类、甾醇生物合成抑制剂类（EBIs）、有机磷类、羟基嘧啶类、甲氧基丙烯酸酯类、苯氧基喹啉等6类杀菌剂产生抗药性的研究报道［4］。随着环境法规制定普及和公众环保意识的加强，减少化学农药的使用，减轻生态环境压力保持农业可持续发展是未来农业的发展趋势［5］。

近年来，利用微生物防治黄瓜白粉病的研究国内外均有报道，Romero等研究3种微生物对黄瓜白粉病的防效，结果表明，枯草芽孢杆菌对瓜类白粉病的防治效果接近于2种重寄生菌和醚菊农药对照［6］。芽孢杆菌作为重要的生防资源已广泛用于防治植物病害［7-11］。本研究通过对1株具有黄瓜白粉病生防效果的细菌进行初步鉴定，确定其遗传地位。并对盆栽黄瓜白粉病的防治效果进行试验验证，分别与商品化生物农药进行对比，以期为该产品的进一步开发奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试黄瓜品种为宝杨5号，为易感病品种，购自上海种子市场。

1.1.2 培养基 菌种分离筛选和活化培养基：3 g牛肉膏，10 g蛋白胨，5 g NaCl，15 g琼脂，1 000 mL自来水，pH值为7.2～7.4。

种子菌液制备和菌种发酵基础培养基：3 g牛肉膏，10 g蛋白胨，5 g NaCl，1 000 mL自来水，pH值为7.2～7.4。

1.1.3 对照药剂 100亿CFU/g枯草芽孢杆菌可湿性粉剂，购自美国拜沃股份有限公司。

1.1.4 试验仪器 主要仪器有摇床、培养箱、洁净工作台、高压灭菌锅，均购自上海博讯实业有限公司医疗设备厂。

1.2 试验方法

1.2.1 拮抗细菌的分离纯化 采用梯度稀释平板涂布法分离黄瓜白粉病根际土壤中的细菌［12］，根据平板上菌落形态、颜色等挑取单菌落进行纯培养。

1.2.2 种子菌液的制备 将分离保存的菌种转接到牛肉膏蛋白胨培养基平板上，在28℃温度条件下培养48 h进行活化，活化后挑取部分菌落接于装液量为100 mL的250 mL锥形瓶的种子菌液制备培养基中，30℃，180 r/min振荡培养48 h即为种子菌液。

1.2.3 发酵液的制备 将发酵好的种子液按5%（体积比）的比例接种到装有200 mL菌种发酵基础培养基的500 mL锥形瓶中，30℃，180 r/min振荡培养72 h备用。

1.2.4 拮抗细菌的筛选 以黄瓜白粉病病原菌为指示菌，采用活体生测法，筛选对其有效的拮抗细菌。在温室条件下，挑选饱满的黄瓜种子播种到小花盆里，保湿，置于25℃室温下光照培养。待黄瓜幼苗长出2张真叶时，挑选长势一致的黄瓜苗，将分离筛选的细菌发酵液浓度调至1010CFU/mL，喷洒于黄瓜叶片上，待药液晾干后接种孢子浓度大概为10万个/mL左右的悬浮液，用接种喷雾器在黄瓜苗上均匀喷雾接种，大概接种2 h（为确定筛选的拮抗细菌是否具有预防效果，于接种白粉病菌前24 h进行发酵液的喷洒）后试材自然风干，然后移至恒温（24℃左右）室灯光下，培养期间每天保温、保湿。于1、2周后按黄瓜白粉病的常规分级标准及方法计算病情指数和防治效果，每个处理重复3次。对照药剂为枯草芽孢杆菌可湿性粉剂，以清水作为空白对照。

酱油主要由大豆、淀粉、和小麦粉经过发酵而成，这些成分在被人体吃下之后都会变成无色的氨基酸和多肽混合物，而其黑色来源于其中所含的焦糖色素，并不会促进黑色素形成也不会沉积在皮肤或伤口上，不必担心变黑。

1.2.5 生防菌株SDNY-038对黄瓜白粉病温室盆栽生物活性的检测 采取盆栽的方法，检测生防菌株SDNY-038试验样品对黄瓜白粉病的活体抑制效果。检测方法同拮抗细菌的筛选。

1.2.6 生防菌株SDNY-038的鉴定

1.2.6.1 生防菌株SDNY-038的培养性状与形态特征 在活化培养基上观察菌株SDNY-038的生长情况，菌落形态采用革兰氏染色，按常规操作试验［13］。

1.2.6.2 生防菌株SDNY-038的16S rDNA片段的扩增与序列分析 菌株基因组DNA的提取参照Sambrook等的方法［14］；引物为扩增细菌16S rDNA的通用引物［15］，正向引物：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′，反向引物：5′-ACGGCTA CCTTGTTACGACT-3′。PCR产物由山东省农业科学院测序中心进行测序，将结果在GenBank中进行Blast同源序列检索。采用ClustalX 2.0软件进行多序列匹配排列，用系统发生推断软件包MEGA 3.1转化成Mega格式后进行系统发育分析。采用Kimura-2-Parameter模型，用邻接法（neighborjoining，简称NJ）法构建系统发育树，自举分析10 000次重复检测分子系统树的置信度，最后确定菌株SDNY-038的分类地位。

1.3 数据分析

采用Excel软件进行数据分析以及差异性分析。

2 结果与分析

2.1 拮抗细菌的分离筛选

采用活体生测方法对土壤中分离得到的细菌进行筛选，对黄瓜白粉病致病菌有防效的菌株相对较少，拮抗能力较强的菌株只占2.5%左右，有较弱拮抗作用的菌株占5%，其他均无防效。选取拮抗能力较强的1株拮抗细菌编号为SDNY-038，经过多次复筛，均表现出较好的生防效果，提前2 h喷洒和提前24 h喷洒与清水对照相比均具有显著性差异，提前2 h喷洒在7、14 d后的防治效果分别为87.45%、87.35%，提前24 h喷洒在7、14 d后的防治效果分别为57.84%、41.70%，提前2 h喷洒比提前24 h喷洒在7、14 d后分别提高29.61、45.65百分点（图1）。

2.2 生防菌株SDNY-038对黄瓜白粉病盆栽防治效果

盆栽测定结果显示，对生防菌株SDNY-038在施药7 d后的喷施效果进行调查，生防菌株SDNY-038的病情指数和防治效果分别为3.31、78.00%，防治效果比阳性对照药剂高出59.93百分点，14 d后的病情指数和防治效果分别为12.11、84.67%，防治效果比阳性对照药剂高出66.37百分点，病情指数与防治效果与空白对照相比均呈显著性差异（图2）。

2.3 生防菌株SDNY-038的形态特征以及生理生化鉴定结果

生防菌株SDNY-038在基础培养基上生长迅速，菌落呈圆形，乳白色，不透明，无皱褶，边缘不规则，菌落表面光滑，湿润，经革兰氏染色鉴定为革兰氏阳性菌，能水解淀粉和还原硝酸盐，葡萄糖、木糖、甘露糖以及柠檬酸盐生长试验反应均为阳性。

2.4 生防菌株SDNY-038的16S rDNA的序列分析和系统发育树构建

经测序，生防菌株SDNY-038的16S rDNA全长序列为1 471 bp，在GenBank数据库中进行Blast比对，结合进化树（图3）分析，结果显示其与芽孢杆菌属（Bacillus sp.）相关家族亲缘关系最为接近，同源性达到99%。结合相关的形态特征以及生理生化鉴定结果，可以初步判断生防菌株SDNY-038为芽孢杆菌。

3 讨论与结论

近几年，随着国家对环境安全越来越重视，化学农药新品种的登记以及产品生产的门槛越来越高，生物农药的研制成为大势所趋，发掘高效低毒的生物农药并不容易，尽管过去几年人们开发的生物农药数不胜数，但真正有较好防治效果的产品是少之又少。对黄瓜白粉病具有防效的生防菌在国内外有不少的报道［16-18］，说明生防菌用于黄瓜白粉病的防治具有较大的发掘潜力。

通过对黄瓜白粉病根际土壤菌进行分离纯化，以及活体黄瓜白粉生测试验筛选，发现1株对白粉病具有较好防治效果的生防细菌，通过对该菌株16S rDNA进行鉴定，结合相关的生理生化特征，发现其与芽孢杆菌属于同一属，具有较好的预防保护效果，在对幼苗处理7、14 d后的防效分别达到78.00%、84.67%，持效期较长，具有较好的应用开发前景。