苏密龙

I型NKT细胞（invariant nature killer T，iNKT）是一群由α-GalCer特异性激活的淋巴细胞，活化的iNKT细胞能够产生IL-4、IFN-γ等多种细胞因子，参与机体免疫调节，在抗HBV复制过程中起到重要的作用[1]。研究显示[2]，iNKT功能的下降是导致HBV病毒不能被完全清除的原因之一。慢性HBV感染者的外周iNKT细胞产生IFN-γ的能力降低，使HBV慢性感染。动物实验结果显示[3]，对HBV感染转基因鼠注射α-GalCer，可使iNKT细胞活化，有利于产生IFN-γ因子，从而抑制HBV复制。本次选取48例处于不同免疫时期的慢性HBV患者，了解其外周血iNKT细胞的数量情况，以及iNKT细胞分泌细胞因子的能力，为慢性HBV感染患者的治疗提供参考依据，具体报道如下。

1 资料和方法

1.1 一般资料

选取2015年1月—2018年9月我院收治的确诊为慢性HBV感染者48例，分别处于免疫耐受期（13例）和免疫清除期（35例）。免疫耐受期男性9例、女性4例，年龄16～63岁，平均年龄（37.2±11.5）岁；免疫清除期男性27例、女性8例，年龄18～60岁，平均年龄（37.4±10.8）岁。纳入标准：患者的诊断均符合2015中国慢性乙型肝炎防治指南版的标准[4]；排除标准：（1）因其他肝炎病毒感染的患者；（2）酒精性肝病患者；（3）纳入研究前半年经过抗病毒和免疫治疗的患者；（4）自身合并有其他免疫疾病。另选取同期在我院的正常体检人群39例，男性30例、女性9例，年龄28～36岁，平均年龄（30.2±6.2）岁，耐受期组患者、清除期组患者、正常体检组患者的性别、年龄一般资料进行对比，差异无统计学意义（P＞0.05）。

1.2 主要仪器和试剂

淋巴细胞分离液，CD3-PerCP-Cy5-5、IFN-γ-PE-Cy7、TNFα-APC、TCRVα24-FITC、TCRVβ11-PE（Beckman Coulter）、Navios流式细胞仪（Beckman Coulter）。

1.3 实验方法

（1）采集新鲜的促凝血3 mL，静止30 min后，使用3 000 rpm的速度，离心5 min后取上清液，以60 μL，置于-80℃环境中保存。（2）抽取肝素钠凝血4毫升，用生理盐水进行稀释，再加入等体积的淋巴细胞分离上层，以800 rpm的速度离心20 min，吸取单核细胞层后，加入PBS，再以800 rpm的速度离心15 min，400rmp的速度离心5 min，留取沉淀即为外周血单核细胞（PBMC）。（3）在外周血iNKT细胞及其分泌的细胞因子TNF-α和IFN-γ比400μL外周血单核细胞悬液中加入PMA10μL，BFA 8μL和Ionomycin 8μL置入培养箱4 h，PBMC清洗离心，100 μL PBS 重悬后加入CD3-Per-CP-Cy5-5 5 μL、TCRVα24-FITC 5 μL、TCRVβ11-PE 5 μL室温避光孵育30 min；固定、破膜后100 μL PBS 重悬细胞，加入IFN-γ-PE-Cy7 5 μL、TNFα-APC 5 μL 室温避光孵育30 min，PBS 清洗后，加入400 μL PBS 重悬细胞。

1.4 统计学方法

使用SPSS 18.0进行数据处理，计量资料用（均数±标准差）或中位数表示，Mann-Whitney U检验，计数资料采用χ2检验，P＜0.05，差异有统计学意义

2 结果

耐受期组和清除期组患者iNKT细胞占CD3+T细胞的比例低于正常体检组，但差异无统计学意义（U=6.316，P＞0.05），见图1；耐受期组患者的iNKT细胞占CD3+T细胞的比例高于正常体检组，差异无统计学意义（U=33.161，P＞0.05），清除期组患者iNKT细胞占CD3+T细胞的比例低于耐受期组和正常体检组，差异有统计学意义（U=3.269；U=7.127，P＜0.05），见图2。三组患者经PMA刺激后，清除期组患者分泌的IFN-γ和TNF-α占iNKT细胞比例高于正常体检组，差异无统计学意义（U=23.137；U=28.982；U=26.163，P＞0.05），耐受期组患者比例高于清除期组和正常体检组，差异有统计学意义（U=7.112，P＜0.05），见图3、图4。

图1 耐受期组和清除期组患者iNKT细胞占CD3+T细胞的比例

图2 不同组患者的iNKT细胞比例

图3 不同组患者分泌的IFN-γ占iNKT 细胞比例

图4 不同组患者分泌的IFN-α占iNKT细胞比例

3 讨论

肝脏是人体最大的免疫器官，iNKT细胞在肝脏中的含量较为丰富，也同时分布在肝脏、骨髓、脾脏、外周血中，其兼具有NK细胞与T细胞的部分表型，在抗肿瘤和抑制自身免疫中有重要作用[4-7]。动物实验结果显示，在HBV转基因小鼠的肝脏、脾脏等免疫器官中，iNKT细胞的数量呈现下降趋势。张鑫的研究结果显示[8]，iNKT细胞在HBV感染后，增殖能力存在受损的情况。

在此研究背景下，本研究结果显示，耐受期组和清除期组患者iNKT细胞占CD3+T细胞的比例低于正常体检组，差异无统计学意义（P＞0.05），清除期患者的外周血iNKT细胞细胞比例低于耐受期组和正常体检组，差异有统计学意义（P＜0.05），分析原因为在慢性HBV的感染过程中，耐受期的HBV DNA刺激iNKT细胞的分泌，因此细胞比例高于正常体检组，但随着免疫的激活，iNKT细胞逐渐作用于肝，所以高病毒载量的清除期iNKT细胞比例开始下降，而体内的炎症得到控制后，iNKT细胞比例也开始逐渐恢复正常。三组患者经PMA刺激后，清除期组患者分泌的IFN-γ和TNF-α占iNKT细胞比例高于正常体检组，差异无统计学意义（P＞0.05），说明在此过程中，iNKT细胞分泌的IFN-γ和TNF-α没有受到免疫过程的影响，IFN-γ和TNF-α起到了有效抑制HBV复制，并清除HBV的作用。

综上所述，慢性HBV感染患者机体可通过iNKT细胞分泌的IFN-γ和TNF-α来抑制HBV的复制过程，感染过程中外周血iNKT 细胞有所数量减少[9-12]。由于本次研究受到时间和其他客观因素的影响，未能进一步探究导致iNKT细胞比例降低的原因或是否与其他细胞因子有关，有待以后扩大样本量再进行研究。